馬鏈球菌獸疫亞種多重PCR檢測(cè)方法建立及應(yīng)用.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus)是引發(fā)豬鏈球菌病的主要病原，主要引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎、及突發(fā)性死亡。其引起的動(dòng)物疫病呈世界性分布，是目前危害我國(guó)豬群最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一。在危害集約化養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的同時(shí)，該菌對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。 纖連蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding protein，F(xiàn)NZ)是鏈球菌一種重

2、要的表面蛋白和毒力因子，是鏈球菌建立感染所依附的重要的表面分子之一，該蛋白是重要的黏附素之一。其主要的功能是與存在于細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞表面的纖連蛋白(fibronectin,Fn)發(fā)生特異性結(jié)合.馬鏈球菌獸疫亞種的類(lèi)M蛋白(M-like protein，SzP)是一種重要的表面蛋白和毒力因子，具有調(diào)理素功能，且能夠抵抗抗體的吞噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬作用。 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi ssp.zo

3、oepidemicus)豬源菌株的纖連蛋白結(jié)合蛋白序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以ATCC35246株基因組為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增纖連蛋白結(jié)合蛋白和類(lèi)M蛋白基因并定向克隆于PMD-19 T載體中，鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒插入片段的正確性，利用DNAstar軟件，比較所測(cè)序列與不同來(lái)源的鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白序列的同源性，擴(kuò)增的fnz、szp基因片段的長(zhǎng)度為540bp和700bp，該序列與已經(jīng)發(fā)表的馬鏈球菌獸疫亞種相應(yīng)基因的同源性為99％。以上序列的測(cè)

4、定為建立檢測(cè)馬鏈球菌獸疫亞種多重PCR的方法奠定了基礎(chǔ)。 根據(jù)馬鏈球菌獸疫亞種類(lèi)M蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白、超氧化物歧化酶A基因已經(jīng)發(fā)表的序列設(shè)計(jì)和合成引物，建立馬鏈球菌獸疫亞種多重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)建立的方法進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果顯示：建立的多重PCR方法具有較好特異性和敏感性，對(duì)14株馬鏈球菌獸疫亞種和6株其它相關(guān)菌株進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，只有馬鏈球菌獸疫亞種能夠同時(shí)擴(kuò)增出類(lèi)M蛋白、fnz，SodA基因；其最低可檢測(cè)模板量為