獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸過程控制與優(yōu)化.pdf

1、透明質(zhì)酸(HA)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通過β-(1→3)和β-(1→4)糖苷鍵連接而成的粘多糖，具有高保濕性、粘彈性和生物相容性等許多優(yōu)良性質(zhì)，在生物醫(yī)藥、化妝品和保健食品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。目前微生物發(fā)酵法已經(jīng)取代動(dòng)物組織提取法成為生產(chǎn)HA的主要方法，隨著HA市場需求的不斷擴(kuò)大，有效提高發(fā)酵法生產(chǎn)HA的產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度至關(guān)重要。本論文依據(jù)HA發(fā)酵系統(tǒng)的混合與傳質(zhì)特性以及生產(chǎn)菌株獸疫鏈球菌Streptococcuszooepide

2、micus自身的生理代謝特性，提出了一系列發(fā)酵優(yōu)化與控制策略，實(shí)現(xiàn)了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA的高產(chǎn)量、高底物轉(zhuǎn)化率與高生產(chǎn)強(qiáng)度的相對(duì)統(tǒng)一，其主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)HA發(fā)酵屬于高粘度發(fā)酵，混合性能差和傳質(zhì)效率低是HA發(fā)酵的一個(gè)重要瓶頸，因此優(yōu)化HA發(fā)酵體系的混合與傳質(zhì)特性至關(guān)重要。首先研究了HA發(fā)酵過程的混合與傳質(zhì)特性，然后運(yùn)用徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò).具有量子行為的粒子群優(yōu)化算法(RBF-QPSO)對(duì)影響混合與傳質(zhì)特性的三

3、個(gè)主要因素(攪拌轉(zhuǎn)速、通氣速率與攪拌器個(gè)數(shù))進(jìn)行優(yōu)化。得到的優(yōu)化條件為：攪拌轉(zhuǎn)速294 rpm，通氣速率1，5 vvm，攪拌器個(gè)數(shù)3.在此條件下HA產(chǎn)量為5.58 g/L，比優(yōu)化前提高了12%(以5.0 g/L為對(duì)照)；
　　 (2)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在上述優(yōu)化條件下HA發(fā)酵體系仍沒有處于全混合狀態(tài)，于是進(jìn)一步研究了全混合狀態(tài)對(duì)HA發(fā)酵的影響。結(jié)果表明在全混合狀態(tài)下雖然混合與傳質(zhì)效率得到明顯提高，但是HA產(chǎn)量反而下降，這可能是因?yàn)樵?/p>

4、全混合狀態(tài)下高攪拌轉(zhuǎn)速(高剪切力)對(duì)細(xì)胞的剪切作用較大，降低了細(xì)胞的生理代謝活性，表明低剪切、高傳質(zhì)效率和高溶氧水平是HA發(fā)酵的較理想方式；
　　 (3)基于上述研究結(jié)果，進(jìn)一步研究了添加氧載體正十二烷對(duì)HA發(fā)酵過程的影響，結(jié)果表明，當(dāng)添加的正十二烷濃度為5%(v/v)時(shí)，8-16 h期間的平均體積溶氧傳遞系數(shù)(KLa)為37 h-1，是添加前的3.7倍；HA產(chǎn)量達(dá)到6.3 g/L，提高了26%；
　　 (4)在上述研究

5、基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了在發(fā)酵過程中通過降解HA提高發(fā)酵體系混合與傳質(zhì)效率的可能性?？疾炝嗽诎l(fā)酵過程中添加透明質(zhì)酸酶對(duì)HA發(fā)酵過程的影響，研究結(jié)果表明在發(fā)酵過程中添加透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸能夠顯著改善發(fā)酵體系的混合與傳質(zhì)特性，當(dāng)添加的透明質(zhì)酸酶濃度為0.25 g/L時(shí)，HA分子量由1300 kDa降為21kDa，發(fā)酵體系處于完全混合狀態(tài)，KLa為100 h-1，HA產(chǎn)量為6.0 g/L，提高了20%；
　　 (5)出于對(duì)生產(chǎn)成本的考慮

6、，進(jìn)一步考察了在發(fā)酵過程中同時(shí)添加過氧化氫和抗壞血酸對(duì)HA發(fā)酵過程的影響，在發(fā)酵8h和12 h兩次添加過氧化氫和抗壞血酸以氧化還原降解HA也能夠顯著改善發(fā)酵體系的混合與傳質(zhì)特性，當(dāng)添加的過氧化氫濃度為1.0mmol/g HA、抗壞血酸濃度為0.5 mmol/g HA時(shí)，KLa從3.7 h-1提高到49 h-1，HA產(chǎn)量為6.5 g/L，提高了26%；
　　 (6)基于HA在獸疫鏈球菌中的生理功能以及細(xì)胞在脅迫環(huán)境下的物質(zhì)及能量代

7、謝的應(yīng)答機(jī)理，考察了流加H2O2進(jìn)行氧化脅迫對(duì)HA發(fā)酵過程的影響，研究發(fā)現(xiàn)在分批培養(yǎng)過程中流加H2O2進(jìn)行氧化脅迫能夠轉(zhuǎn)變細(xì)胞產(chǎn)能途徑、提高細(xì)胞產(chǎn)能效率和提高HA合成速率，當(dāng)H2O2流加速率為0.06 mmol L-1 h-1時(shí)，HA的產(chǎn)量達(dá)到6.0 g/L，比對(duì)照提高了20%；
　　 (7)提出了一種間歇性pH脅迫策略：前0-6 h期間控制pH為7.0，在6-7 h期間控制pH為8.5，在7-8 h期間控制pH為7.0，在8-

8、9 h期間再將pH調(diào)到8.5，如此循環(huán)下去，直至發(fā)酵結(jié)束。在此脅迫策略控制下，HA產(chǎn)量提高到6.5 g/L，提高了30%；
　　 (8)考察了HA發(fā)酵過程中常見氨基酸的代謝動(dòng)力學(xué)，確定精氨酸、半胱氨酸和賴氨酸是影響細(xì)胞生長和HA合成的關(guān)鍵氨基酸；考察了添加核苷酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶)對(duì)HA發(fā)酵過程的影響，發(fā)現(xiàn)尿嘧啶對(duì)HA發(fā)酵具有重要影響。運(yùn)用RBF-QPSO算法對(duì)關(guān)鍵營養(yǎng)因子的添加濃度進(jìn)行了優(yōu)化，最佳添

9、加濃度為：精氨酸0.062 g/L，半胱氨酸0.036 g/L，賴氨酸0.043 g/L，尿嘧啶0.06 g/L時(shí)，在此條件下，HA產(chǎn)量提高到6.3 g/L，提高了26%；
　　 (9)研究了不同培養(yǎng)模式對(duì)HA發(fā)酵過程的影響，發(fā)現(xiàn)采用分批培養(yǎng)可獲得較高的碳源對(duì)HA的轉(zhuǎn)化率，而補(bǔ)料分批培養(yǎng)可獲得較高的細(xì)胞比生長速率，于是提出了一種兩階段培養(yǎng)模式：在第一階段內(nèi)(0-8 h)進(jìn)行指數(shù)流加培養(yǎng)，在8h提高碳源濃度至25 g/L，進(jìn)行第二