透明質(zhì)酸發(fā)酵法制備及其復(fù)合改性研究.pdf

1、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡(jiǎn)稱HA)是一種重要的醫(yī)藥材料和化妝品原料,并被列為新資源食品。近年來,微生物發(fā)酵法已經(jīng)逐步取代了動(dòng)物組織提取法,成為制備HA的主要方法。
　　 在發(fā)酵法制備HA的過程中,需要對(duì)大量發(fā)酵液樣品進(jìn)行HA含量的測(cè)定。傳統(tǒng)的Bitter-Miur法測(cè)定步驟繁瑣,以濃硫酸.咔唑溶液為反應(yīng)試劑,具有一定危險(xiǎn)性。本研究考察了十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium brom

2、ide,簡(jiǎn)稱CTAB)與HA反應(yīng)產(chǎn)生混濁的特性,建立了CTAB比濁法:配制25 mg/ml的CTAB試液,選擇400 nm作為CTAB比濁法的吸收波長(zhǎng),在室溫下,將純化后的樣液與CTAB試液準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,各樣品的測(cè)定時(shí)間誤差控制在10 s以內(nèi),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出待測(cè)樣中HA含量。試驗(yàn)表明,CTAB比濁法的準(zhǔn)確度、精確度和靈敏度均高于Bitter-Muir法。除了蛋白質(zhì)外,其它雜質(zhì)對(duì)CTAB比濁法影響較小。該法安全性高,操作簡(jiǎn)便快

3、捷,適合對(duì)大量發(fā)酵液樣品進(jìn)行測(cè)定,適用于測(cè)定HA的分子量范圍為≥50000 Da。
　　 本研究以馬疫鏈球菌(Streptococcus equisimilis)為出發(fā)菌,通過紫外線和60Co-γ射線輻照相結(jié)合的方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變選育,篩選出無溶血性、HA產(chǎn)量和分子量均較高的突變株NC168,其HA產(chǎn)量為150.61 mg/L,分子量為677000 Da。突變株經(jīng)過多次傳代,HA產(chǎn)量和HA分子量保持穩(wěn)定,溶血性無回復(fù)突變現(xiàn)象

4、,為進(jìn)一步研究發(fā)酵法生產(chǎn)HA打下了基礎(chǔ)。
　　 針對(duì)突變株NC168,通過單因素試驗(yàn)和二次正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,并建立了回歸模型:
　　 Y=174.76168+6.09122X3-9.26943X12-12.92694X22.-14.36237X32.-12.20569X42由此得到了最佳培養(yǎng)基:酵母膏30 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖5 g/L和MgSO4·7H2O1.5g/L,模型預(yù)測(cè)HA

5、產(chǎn)量為174.76 mg/L,,驗(yàn)證試驗(yàn)HA產(chǎn)量達(dá)到178.53/mL,模型能較好的預(yù)測(cè)HA產(chǎn)量。將此培養(yǎng)基應(yīng)用于5 L發(fā)酵罐,進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)。研究表明:pH值,初糖濃度,溫度和攪拌速度對(duì)HA產(chǎn)量均有顯著影響。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:pH值為7.0,初糖濃度為30 g/L,溫度35℃,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵HA的產(chǎn)量可達(dá)3.0 g/L。在發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上,以Logistic,Slogistic和Sgompertz

6、三種模型對(duì)菌體生長(zhǎng)過程中生物量和HA產(chǎn)量進(jìn)行非線性擬合,結(jié)果表明,生物量模型以Logistic模型擬合效果最佳,擬合方程為:y=2.933-2.849/1+(x/11.185)4.453,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.999;而在HA合成擬合中,以Slogistic模型最佳,擬合方程為:y=1.900/1+e-0.318(x-13.413),相關(guān)系數(shù)R2為0.996;在對(duì)基質(zhì)(葡萄糖)的消耗擬合中,采用DoseResp模型,擬合方程為:y=2.0

7、85+26.566/1+100.15x-2.80,相關(guān)系數(shù)R2為0.991。
　　 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀與超濾相結(jié)合的方法對(duì)HA進(jìn)行分離純化。將發(fā)酵液稀釋到HA含量為0.6-0.8 g/L,加入發(fā)酵液體積15％的CTAB溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％),在35℃下沉淀1 h,將沉淀置于濃度為1.5 mol/L的NaCl溶液中解離4 h,選擇濃度為70％乙醇進(jìn)行沉淀。經(jīng)上述處理后HA得率可達(dá)93.8％,HA中蛋白含量可

8、降至1.5％。選擇截留分子量為100 Kda的超濾膜對(duì)經(jīng)過季銨鹽沉淀得到的HA進(jìn)行超濾,樣液濃度為0.02％-0.05％,過膜壓力為11 psi,HA得率可達(dá)到93.5％,蛋白去除率達(dá)到94.0％。經(jīng)分離純化后,HA總得率為87.7％,HA中蛋白含量可降至0.09％,葡萄糖醛酸含量可達(dá)43.5％,達(dá)到醫(yī)藥級(jí)水平。
　　 為了獲得性能良好的HA水凝膠,選擇分子量為1500000 Da的HA與海藻酸鈉(sodium alginate

9、,簡(jiǎn)稱SAL)進(jìn)行復(fù)合改性。以醋酸鹽緩沖液作為調(diào)節(jié)pH的試劑,碳化二亞胺(EDC)作為羧基激活劑,已二酰肼(ADH)作為交聯(lián)劑,制備了HA-SAL復(fù)合水凝膠。通過紅外光譜驗(yàn)證了HA與SAL之間形成的酰胺鍵,通過電鏡觀察了所形成凝膠的微結(jié)構(gòu)。質(zhì)構(gòu)特征分析表明,凝膠的硬度隨著兩種多糖濃度升高而增加,隨著HA/SAL摩爾比例升高而減小。凝膠的溶脹率與HA的比例成正相關(guān),而與EDC用量成負(fù)相關(guān)。隨著SAL比例和EDC用量的增加,所形成凝膠的抗透