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文檔簡介
1、獸疫鏈球菌是工業(yè)上生產(chǎn)透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)的主要菌株,但是獸疫鏈球菌中HA合成途徑中基因的功能還沒有得到系統(tǒng)的研究。目前,幾株獸疫鏈球菌全基因組序列的公布及HA生物合成途徑的闡述,為HA合成途徑中基因的功能研究提供了理論基礎(chǔ)。本論文以獸疫鏈球菌ATCC39920為研究對象,主要研究結(jié)果如下:
(1)通過BLAST發(fā)現(xiàn)獸疫鏈球菌HA合成途徑中所有基因均存在且通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)11個基因都得到表達(dá)
2、。分析發(fā)現(xiàn),均有兩個不同的基因編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸變位酶和雙功能酶(乙?;D(zhuǎn)移酶和焦磷酸化酶),編碼其他酶的基因只有一個;在has操縱子上有5個連續(xù)排列的基因,包括hasA、hasB、hasC1、hasD、hasE,其余基因均在遠(yuǎn)離has操縱子的位置。
(2)對編碼葡萄糖-6-磷酸變位酶的兩個基因pgm、pgmA功能的研究。通過表型和發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,Δpgm長勢相對較快,ΔpgmΔpgmA
3、長勢相對較弱,且ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA菌落與野生型相比菌落較小,沒有粘性莢膜,發(fā)酵分析中也檢測不到HA;進(jìn)一步對Pgm及PgmA進(jìn)行體外表達(dá)、純化及酶活檢測,發(fā)現(xiàn)PgmA對底物葡萄糖-1-磷酸的特異性更強;體內(nèi)酶活分析發(fā)現(xiàn),Δpgm、ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA的PGM酶活分別比野生型菌株降低了38.1%、69.6%、84.2%。以上結(jié)果表明,Pgm和PgmA在獸疫鏈球菌體內(nèi)均發(fā)揮葡萄糖-6-磷酸變位酶作用,且pgmA對HA的
4、生物合成起著更重要的作用。
(3)對編碼葡萄糖胺-6-磷酸合成酶基因glmS功能的研究。利用基因插入失活的方法篩選得到ΔglmS,且ΔglmS在不添加葡萄糖胺(GlcN)的THY培養(yǎng)基中不能生長;進(jìn)一步研究GlcN的濃度對ΔglmS生長的影響時發(fā)現(xiàn),當(dāng)GlcN添加濃度為1 mg/mL時,ΔglmS的長勢與野生型菌株差不多。以上結(jié)果表明,glmS是獸疫鏈球菌中編碼葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的基因,而且可以作為一種篩選標(biāo)記基因。
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