獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸代謝途徑中基因功能研究.pdf

1、獸疫鏈球菌是工業(yè)上生產(chǎn)透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)的主要菌株，但是獸疫鏈球菌中HA合成途徑中基因的功能還沒(méi)有得到系統(tǒng)的研究。目前，幾株獸疫鏈球菌全基因組序列的公布及HA生物合成途徑的闡述，為HA合成途徑中基因的功能研究提供了理論基礎(chǔ)。本論文以獸疫鏈球菌ATCC39920為研究對(duì)象，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)BLAST發(fā)現(xiàn)獸疫鏈球菌HA合成途徑中所有基因均存在且通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)基因都得到表達(dá)

2、。分析發(fā)現(xiàn)，均有兩個(gè)不同的基因編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸變位酶和雙功能酶（乙?；D(zhuǎn)移酶和焦磷酸化酶），編碼其他酶的基因只有一個(gè);在has操縱子上有5個(gè)連續(xù)排列的基因，包括hasA、hasB、hasC1、hasD、hasE，其余基因均在遠(yuǎn)離has操縱子的位置。
　　(2)對(duì)編碼葡萄糖-6-磷酸變位酶的兩個(gè)基因pgm、pgmA功能的研究。通過(guò)表型和發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Δpgm長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較快，ΔpgmΔpgmA

3、長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，且ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA菌落與野生型相比菌落較小，沒(méi)有粘性莢膜，發(fā)酵分析中也檢測(cè)不到HA;進(jìn)一步對(duì)Pgm及PgmA進(jìn)行體外表達(dá)、純化及酶活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PgmA對(duì)底物葡萄糖-1-磷酸的特異性更強(qiáng);體內(nèi)酶活分析發(fā)現(xiàn)，Δpgm、ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA的PGM酶活分別比野生型菌株降低了38.1％、69.6％、84.2％。以上結(jié)果表明，Pgm和PgmA在獸疫鏈球菌體內(nèi)均發(fā)揮葡萄糖-6-磷酸變位酶作用，且pgmA對(duì)HA的

4、生物合成起著更重要的作用。
　　(3)對(duì)編碼葡萄糖胺-6-磷酸合成酶基因glmS功能的研究。利用基因插入失活的方法篩選得到ΔglmS，且ΔglmS在不添加葡萄糖胺(GlcN)的THY培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng);進(jìn)一步研究GlcN的濃度對(duì)ΔglmS生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GlcN添加濃度為1 mg/mL時(shí)，ΔglmS的長(zhǎng)勢(shì)與野生型菌株差不多。以上結(jié)果表明，glmS是獸疫鏈球菌中編碼葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的基因，而且可以作為一種篩選標(biāo)記基因。