豬鏈球菌2型IMPDH基因功能結(jié)構(gòu)域的確定.pdf

1、原創(chuàng)性聲明本人鄭重盧明：所節(jié)交的學位論文，是本人在導師的指導F，獨立進行研究J：作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引心的內(nèi)容外，本論文不包食任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰弓過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本盧明的法律結(jié)果由本人承擔。學位論文作者c需耥虢禮節(jié)件舌月刀日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使川學位論文的規(guī)定同意學校保留并向國家有關(guān)部『J或機構(gòu)送交論文

2、的復印件和電子版，允許論文被殼閱幣l借閱。本人授權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采HJ描等復制手段保存和匯編本學位論文。保密口，在一年解密后適用本授權(quán)書。本學位論文屬于不保(請在以上方框內(nèi)打“4”)學位論文作者(需親筆)導師(需親筆)簽名：嘛f月乃日州年二月哆日輔鏈球菌2型IMPDH皋州功能結(jié)構(gòu)域的確定豬鏈球菌2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因功能結(jié)構(gòu)域的確定摘要豬鏈球菌2型(Streptococcu

3、ssuisserotype2SS2)是我國豬鏈球茵病的重要病原，不僅可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎心內(nèi)膜炎，敗血癥、肺炎和突然死亡，還可感染相關(guān)人員并致死，是一種重要的人畜共患病病原在SS2中，可區(qū)分為強毒株、弱毒株和無毒株，已發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)，溶血素(SLY)，NewORF2，莢膜多糖(CPS)，纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBP)、谷氨酸脫氫酶(GDH)，分泌型核酸(SSnA)和三磷酸甘油醛脫氫酶

4、(GAPDH)等在orf2和mrp之間存在一個新的開放閱讀框，本課題組通過活性染色已證實該閱讀框具有次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)活性，通過Interpro和PHI)軟件分析IMPDH的結(jié)構(gòu)域模型為【LIVMT]【RK】[LIVM]G一[LIVM]GXG[SEN][LIVMAT]CXT，其中半胱氨酸殘基(C)為底物IMP的結(jié)合部位且已證實IMPDH基因的融合表達蛋白可延長HEp2細胞的S期。1豬鏈球菌2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的分

5、片段缺失與表達該閱讀框共有957bp個堿基，編碼319個氨基酸，未發(fā)現(xiàn)一個半胱氨酸殘基(c)通過軟件分析功能結(jié)構(gòu)域存在于第9798bp基因片段所編碼的蛋白質(zhì)中，對這789bp個堿基，每次缺失大約200bp以找其酶的催化部位和底物結(jié)合部位按照正確的閱讀順序自行設計八對引物，引物兩端分別添加限制性酶切位點EcoRI、XhoI或NcoI及保護性堿基，且相應的片段通過EcoRI酶切位點去串聯(lián)并克隆至pET32a()栽體中共構(gòu)建五個重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化

6、至大腸桿菌BL21中，表達出分子量分別為453kDa，438kDa，426kDa，433kDa的四個缺失蛋白和一個分子量為522kDa的全長蛋白2豬鏈球菌2型IMPDH基因功能結(jié)構(gòu)域的確定豬鏈球菌2型IMPDH基因的分片段缺失克隆和表達，共原核表達出五個融合蛋白。表達的五個重組蛋白都含有6個連續(xù)的組氨酸殘基，利用能與Ni2結(jié)合的特性，進行純化五個重組蛋白經(jīng)NiNTAHisBindResin進行非變性條件純化后，獲得相應的蛋白免疫轉(zhuǎn)印這4