豬鏈球菌2型TypeⅡ毒素-抗毒素系統(tǒng)的鑒定與功能研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）是引起豬鏈球菌病的主要病原體，是上呼吸道的條件致病菌，一旦豬發(fā)病可引起多種疾病，如腦膜炎，敗血癥，關節(jié)炎，心內膜炎，甚至導致死亡，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。在33個血清型中，豬鏈球菌2型（Streptococcus suis2，S.suis2）被認為是養(yǎng)豬行業(yè)中是最流行的，也是毒力最強的病原菌，而且S.suis2還是一種嚴重的人獸共患病原體，可致人腦膜炎和毒素休克綜合征。毒素抗毒素系

2、統(tǒng)(toxin-antitoxin system，TAS)是細菌基因組中廣泛存在的一類小型遺傳元件，最初發(fā)現(xiàn)于低拷貝質粒上，用于維持質粒的穩(wěn)定性，基因組中的TAS改變了細菌的生理框架，使其提高對外界環(huán)境的適應能力，促使細菌成為優(yōu)勢菌。本課題通過對預測的7對TypeⅡ TAS進行初步的鑒定篩選，探究缺失TAS突變株在毒力方面的影響，取得的主要結果如下:
　　1.RT-PCR驗證毒素抗毒素基因共轉錄
　　提取S.suis2（SC

3、19菌株）的總RNA，反轉錄得到cDNA，然后以cDNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增，驗證毒素抗毒素基因共轉錄情況，證明毒素抗毒素是由同一操縱子調控轉錄的。
　　2.毒素和抗毒素功能特性的探究
　　構建成功的重組質粒pBADHisA-toxin(pBADHisA-T)轉化至Top10感受態(tài)細胞，加入阿拉伯糖誘導毒素表達，繪制生長曲線同時進行活菌計數(shù)。結果表明誘導毒素表達時，含有pBADHisA-T1，pBADHisA-

4、T5，pBADHisA-T7，pBADHisA-T9的菌株生長受到明顯抑制，誘導毒素表達2h后，其中含有pBADHisA-T1，pBADHisA-T7，pBADHisA-T9的細菌生長趨勢已經基本不變，而含有pBADHisA-T5的細菌生長變慢;活菌計數(shù)結果表明誘導毒素蛋白1(T1)，毒素蛋白7(T7)，毒素蛋白9(T9)表達，對細菌有明顯的殺菌作用，但細菌并沒有被全部殺死，4h后仍然存活的細菌開始緩慢恢復生長，而誘導表達毒素蛋白5(T

5、5)對細菌沒有明顯的殺菌作用。
　　為進一步確定并驗證豬鏈球菌中存在的毒素抗毒素系統(tǒng)，我們將構建成功的重組質粒pET30a-antitoxin，和pBADHisA-toxin一起共轉化至BL21感受態(tài)細胞，加入IPTG和阿拉伯糖，分別誘導抗毒素和毒素表達，繪制細菌的生長曲線，觀察抗毒素能否中和毒素，同時對誘導5h后的細菌革蘭氏染色，觀察細菌在誘導毒素抗毒素蛋白表達情況下的形態(tài)。結果表明抗毒素蛋白1(A1)，抗毒素蛋白7(A7)，抗

6、毒素蛋白9(A9)能夠中和相應的毒素蛋白，使細菌生長恢復正常，而只誘導T1，T7，T9表達的細菌，生長明顯受到限制，而只誘導T5表達的細菌，生長則恢復到正常水平，說明第5對不是毒素抗毒素系統(tǒng)。革蘭氏染色結果表明毒素抗毒素的誘導表達可使E.coli形態(tài)發(fā)生改變，形成明顯的絲狀，可能是細菌的一種保護機制。
　　3.毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株、互補菌株的構建及鑒定
　　根據(jù)上述實驗結果，對第1對，第7對，第9對毒素抗毒素系統(tǒng)構建相對

7、應的基因缺失突變株。運用溫敏性質粒pSET4s構建重組質粒，電轉化至SC19感受態(tài)細胞，運用溫度和壯觀霉素抗性篩選得到得到單交換菌株，通過第二次同源重組篩選到基因缺失突變株缺失突變株。運用pSET2構建互補質粒，電轉化至相應的毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株中，以抗性篩選得到互補菌株，最后通過PCR擴增和DNA測序的方法，證明毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株和互補菌株構建成功。
　　4.毒素抗毒素系統(tǒng)缺失突變株對S.suis2的影響
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