2型豬鏈球菌89K毒力島上毒素——抗生素系統(tǒng)SezAT的發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype2，S.suis2)是一種重要的人畜共患病病原體。S.suis2感染不僅可致豬的急性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎及急性死亡，并且可通過(guò)呼吸道和傷口等途徑傳播，導(dǎo)致人類(lèi)的感染發(fā)病和死亡?？茖W(xué)家在丹麥發(fā)現(xiàn)并首次報(bào)道人感染S.suis2病例，隨后在世界各地都有報(bào)道，但多為散發(fā)病例。然而，1998年和2005年我國(guó)江蘇省和四川省分別暴發(fā)大規(guī)模S.suis2感染豬和人類(lèi)疫情，

2、病人中出現(xiàn)高比例的、國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)的鏈球菌中毒性休克綜合征(streptococcal toxicshock syndrome，STSS)，臨床癥狀表現(xiàn)為急性高熱、休克、全身多器官衰竭，病程短而兇險(xiǎn)，致死率高，引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。
　　 為了對(duì)造成這兩次暴發(fā)感染事件的S.suis2流行菌株的高致病性進(jìn)行深入研究，我們課題組對(duì)1998年江蘇分離的強(qiáng)致病株98HAH12和2005年四川分離的強(qiáng)致病株05ZYH33(兩株均分離自STS

3、S病人)進(jìn)行了全基因組測(cè)序和功能注釋?zhuān)⑴cSanger研究中心公布的標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)1/7的全基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了我國(guó)分離的這兩株測(cè)序菌株均含有一個(gè)89 kb大小的具有毒力島(pathogenicity island，PAI)特征的大片斷，我們將這個(gè)特異性的片段命名為89K PAI。隨后對(duì)89K PAI行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)89K PAI編碼多個(gè)可能與致病相關(guān)的成分和結(jié)構(gòu)，如二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signaltra

4、nsduction system，TCS)，Ⅳ型分泌樣系統(tǒng)(typeⅣ-like secretion system，T4SS-like)以及一個(gè)Zeta毒素等。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SalK/SalR參與了細(xì)菌的致病過(guò)程，而Ⅳ型樣分泌系統(tǒng)則參與了STSS的形成。
　　 近期研究表明該毒力島可以從宿主菌染色體上自發(fā)切離下來(lái)，并在染色體上形成類(lèi)似質(zhì)粒的環(huán)化分子，該環(huán)化分子可作為底物通過(guò)Ⅳ型樣分泌系統(tǒng)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移至不含89

5、K毒力島的S.suis2受體菌中。我們?cè)噲D通過(guò)各種誘導(dǎo)質(zhì)粒消除的方法獲得一株89K毒力島缺失的S.suis2突變株，但始終未能成功。我們推測(cè)毒力島上存在一個(gè)參與穩(wěn)定作用的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)89K毒力島有一個(gè)與Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素(typeⅡ toxin-antitoxin)系統(tǒng)，我們將其命名為SezAT(Streptococcus suis epsilonzeta)系統(tǒng)，其中SezA為抗毒

6、素蛋白，SezT為毒素蛋白。近期研究發(fā)現(xiàn)TA系統(tǒng)可在細(xì)菌的一些可移動(dòng)遺傳元件中發(fā)揮穩(wěn)定作用。因此，高致病性S.suis2的89K PAI編碼的SezAT系統(tǒng)很可能參與到89K PAI的穩(wěn)定機(jī)制當(dāng)中。但生物信息學(xué)分析結(jié)果只能是提示，該TA系統(tǒng)是否具有生物學(xué)功能尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為此，本文旨在對(duì)89K PAI編碼的SezAT系統(tǒng)行活性驗(yàn)證，并通過(guò)同源重組的方法對(duì)SezAT系統(tǒng)進(jìn)行敲除，為下一步驗(yàn)證其功能和獲得89K PAI缺失突變株奠定基礎(chǔ)。具

7、體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　 1.SezAT系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和RT-PCR驗(yàn)證：我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，89K PAI的負(fù)鏈上05SSU0936(sezT)和05SSU0937(sezA)構(gòu)成一對(duì)Ⅱ型TA系統(tǒng)并與Epsilon-zeta(ε-ζ)同源，且兩ORF有一個(gè)堿基對(duì)的重疊，提示兩ORF共轉(zhuǎn)錄。為證實(shí)兩ORF共轉(zhuǎn)錄，抽提S.suis2的總RNA行RT-PCR，結(jié)果證實(shí)兩ORF共轉(zhuǎn)錄。
　　 2.

8、SezAT系統(tǒng)的活性分析：以05ZYH33基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增SezA和SezT編碼基因的全長(zhǎng)片段，分別插入雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pJS298中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pJS-AT。通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)，分別用一定濃度的誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為1 mM)和L-阿拉伯糖(0.2%)誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)定不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定菌液的OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，單純誘導(dǎo)表達(dá)毒素蛋白SezT可在短時(shí)間內(nèi)迅速抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而同時(shí)

9、誘導(dǎo)表達(dá)抗毒素蛋白SezA可中和SezT的抑制作用，維持細(xì)菌正常生長(zhǎng)。提示該SezAT系統(tǒng)構(gòu)成一對(duì)有活性的TA系統(tǒng)。
　　 3.SezAT系統(tǒng)基因敲除突變株的構(gòu)建：以S.suis05ZYH33的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR分別擴(kuò)增sezT單基因和sezAT的左右臂(上下游片段)；同時(shí)以穿梭質(zhì)粒pSET2的DNA為模板，PCR擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因SpcR片段，分別將它們克隆到pUC18載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建成用于靶

10、基因敲除的載體pUC：：SezT和pUC：：SezAT。分別將敲除載體電轉(zhuǎn)化至05ZYH33感受態(tài)細(xì)菌，篩選具有壯觀霉素抗性的S.suis2菌落。通過(guò)PCR初篩、多重PCR復(fù)篩及測(cè)序的方法獲得具有壯觀霉素抗性的sezT基因敲除突變株△sezT，但未能獲得sezAT的敲除突變株。后續(xù)對(duì)突變株△sezT基本生物學(xué)性狀(生長(zhǎng)速率)及致病性研究顯示與野生株無(wú)明顯差異，提示SezAT系統(tǒng)不直接參與致病過(guò)程。
　　 綜上所述，本研究以S.s

11、uis05ZYH33為研究對(duì)象，通過(guò)生物信息學(xué)分析及RT-PCR檢測(cè)提示89K毒力島上SezAT系統(tǒng)的兩基因共轉(zhuǎn)錄。通過(guò)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)SezAT系統(tǒng)蛋白過(guò)表達(dá)證實(shí)SezAT系統(tǒng)是有活性的TA系統(tǒng)。通過(guò)基因敲除技術(shù)獲得了sezT基因缺失突變株△sezT，成功破壞該TA系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。突變株△sezT基本生物學(xué)性狀研究和小鼠攻毒結(jié)果顯示，sezT基因缺失未影響S.suis2的生長(zhǎng)和致病性，即提示該TA系統(tǒng)與致病性無(wú)直接相關(guān)。下一步我們將以sezT基