豬鏈球菌2型雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)NisKR和BceRS對(duì)毒力調(diào)控的研究.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptocuccus suis 2，S.suis 2）是一種非常重要的豬病原菌，可以引發(fā)豬的關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，腦膜炎，肺炎和敗血癥，同時(shí)也可以引發(fā)人的致死性感染。近些年中國(guó)爆發(fā)的兩次大規(guī)模S.suis 2感染均引起人的中毒休克綜合癥，伴隨有急性高熱，多器官衰竭，病程短，致死率高的特點(diǎn)。這引發(fā)世界公共衛(wèi)生的極大關(guān)注。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)S.suis 2開(kāi)展了大量研究工作，然而對(duì)其迅速增強(qiáng)毒力的潛在機(jī)制知之甚少。
　

2、　雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction systems，TCSTS)廣泛存在于細(xì)菌中，該系統(tǒng)通過(guò)感受外界刺激來(lái)影響特定基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)細(xì)胞的變化，從而在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，發(fā)育途徑，致病性等重要過(guò)程當(dāng)中發(fā)揮的龐大的功能。關(guān)于雙組分NisK/NisR，有報(bào)道認(rèn)為它在乳酸乳球菌中調(diào)控乳鏈球菌素Z的合成;關(guān)于雙組分BceR/BceS，它被證明在枯草芽胞桿菌參與形成四組分系統(tǒng)BceRS-Bce

3、AB，可以感知環(huán)境中抗菌肽并通過(guò)ABC運(yùn)輸?shù)鞍讓⑵鋸淖饔梦稽c(diǎn)移走，從而提高細(xì)胞抵抗能力。然而這兩對(duì)TCSTS在鏈球菌中的功能尚不清楚。
　　NisK/NisR位于89K毒力島上，該島上另一對(duì)TCSTS SalK/SalR已報(bào)道是S.suis 2高致病性的一個(gè)至關(guān)重要的因子。事實(shí)上很多雙組分比如CiaRH，Ihk/Irr,VirR/VirS，RevS and CovR都已報(bào)道和S.suis 2的致病性有關(guān)。因此，本課題以NisK/N

4、isR和BceR/BceS為研究對(duì)象，探討了這兩對(duì)雙組分對(duì)S.suis 2毒力的影響，同時(shí)初步研究了兩對(duì)系統(tǒng)可能調(diào)控的一些基因。主要研究?jī)?nèi)容:
　　1.S.suis 2雙組分系統(tǒng)NisKR和BceRS基因缺失突變株的構(gòu)建和鑒定
　　依據(jù)豬鏈球菌二型05ZYH33全基因組序列設(shè)計(jì)引物。以SC19基因組為模板，溫敏自殺性質(zhì)粒pSET4s為穿梭載體，利用同源重組原理成功獲得二次交換基因缺失突變株ΔnisKR和ΔbceRS，并通過(guò)P

5、CR和Southern blot驗(yàn)證。
　　2.S.suis 2雙組分系統(tǒng)NisKR和BceRS基因缺失突變株的生物學(xué)特性研究
　　我們研究了突變株的生長(zhǎng)特性和溶血活性，結(jié)果表明:野生株SC19相比，突變株在10％新生牛血清里的生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著差異，但是溶血效價(jià)要降低2倍以上。我們進(jìn)一步以小鼠和細(xì)胞為模型對(duì)基因缺失突變株ΔnisKR和ΔbceRS的毒力進(jìn)行評(píng)價(jià)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:ΔnisKR和ΔbceRS對(duì)Hela細(xì)胞的粘附能

6、力顯著降低（分別下降85.4％和53.05％），對(duì)該細(xì)胞的侵入能力也顯著下降(分別下降90.9％和76.77％);抵抗中性粒細(xì)胞(PMN)介導(dǎo)的殺菌作用的能力顯著下降;更容易被小鼠肺泡巨噬細(xì)胞（RAW264.7）吞噬同時(shí)也更容易被該細(xì)胞殺死。BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:以8×108CFU劑量的野生株和突變株分別腹腔注射1ml后觀察到突變株組的臨床癥狀較輕，死亡率顯著低于野生株組;以5×107CFU劑量的野生株和突變株分別感染小鼠后，統(tǒng)

7、計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血，心，肺，腦組織中的載菌量，發(fā)現(xiàn)突變株的含量顯著低于野生株。這表明NisK/NisR和BceR/BceS在S.suis 2致病過(guò)程中有著重要的地位。
　　3.S.suis 2雙組分系統(tǒng)NisK/NisR和BceR/BceS調(diào)控機(jī)制的初步研究
　　本研究提取各菌株RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)比較分析野生株和突變株的差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示:ΔnisKR中有22個(gè)基因下調(diào)2倍以上，7個(gè)基因上調(diào)2倍以上;Δ