表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SaeRS調(diào)控功能的研究.pdf

1、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是寄居于人體皮膚表面常見(jiàn)的一種條件致病菌，通常并不致病。然而，隨著各種人工醫(yī)療材料(如人工瓣膜、靜脈留置管和導(dǎo)尿管等)的普遍使用，表皮葡萄球菌已成為引起醫(yī)院內(nèi)感染主要致病菌之一。表皮葡萄球菌能在醫(yī)療植入材料表面形成生物被膜(Biofilm)樣結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)具有抵抗抗生素治療和宿主免疫系統(tǒng)的作用，從而導(dǎo)致耐藥株產(chǎn)生及慢性感染。
　　 細(xì)菌能夠生存的首要前提是適應(yīng)外

2、界環(huán)境，因此細(xì)菌必須具有感應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)的能力，并迅速將信號(hào)傳入菌體內(nèi)，從而啟動(dòng)一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的修飾，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。大多原核生物利用雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component Signal Transduction Systems，TCSs)的機(jī)制進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控其生物學(xué)特性。TCSs由組氨酸激酶(Histidine Kinase，HK)蛋白和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(Response Regulator，RR

3、)組成，HK含有2個(gè)功能域，即HATPase_c和HisKA功能域。當(dāng)外界信號(hào)作用于組氨酸激酶蛋白的膜外配體結(jié)合區(qū)時(shí)，激活激酶的ATP結(jié)合部位(HATPase_c domain)，HATPase_c功能域可結(jié)合、水解ATP為ADP，并將ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到激酶HisKA功能域的組氨酸位點(diǎn)，使其發(fā)生自身磷酸化。隨后，反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控區(qū)域能與磷酸化的組氨酸蛋白激酶相互作用，將激酶上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身天冬氨酸位點(diǎn)上，發(fā)生自身磷酸化，并能激

4、活效應(yīng)區(qū)，使其構(gòu)像改變，暴露不同DNA結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合不同DNA序列產(chǎn)生一系列調(diào)控反應(yīng)。
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌的生物膜形成分為兩個(gè)主要階段：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌初始黏附到材料表面和細(xì)菌間的互相黏附形成多細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)，并且已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個(gè)階段的一些生物膜相關(guān)基因(如atlE、ica、aap等)。目前已知在金葡菌中SaeRS調(diào)節(jié)毒力相關(guān)因子，比如SPA，Clumping factor等，而在表葡中其生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。

5、
　　 TCSs廣泛存在于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌中，其不僅參與細(xì)菌的基本生命活動(dòng)，目前也發(fā)現(xiàn)它與很多病原菌的毒力和致病性密切相關(guān)。SaeRS在表皮葡萄球菌中的研究還知之甚少，故本論文在建立了表皮葡萄球菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SaeRS刪除株的基礎(chǔ)上，對(duì)其生物學(xué)活性和介導(dǎo)自溶和生物膜形成相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了較全面的研究，并對(duì)胞外基質(zhì)中Aap蛋白及PIA重要成分在表皮葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中的作用及進(jìn)行了較深入的研究。借助于基因芯片和雙向電泳

6、技術(shù)，尋找潛在的受SaeRS調(diào)節(jié)的基因和蛋白，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　 第一章表皮葡萄球菌saeRS基因刪除株的構(gòu)建在金黃色葡萄球菌中研究發(fā)現(xiàn)SaeRS與細(xì)菌許多生物學(xué)功能有關(guān)，而其在表皮葡萄球菌中的生物學(xué)功能尚無(wú)報(bào)道。為了探討表皮葡萄球菌SaeRS雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的saeS基因和saeR基因刪除對(duì)細(xì)菌生物學(xué)功能的影響，我們構(gòu)建了含有壯觀霉素抗性基因(spc)的saeRS刪除質(zhì)粒pMAD△saeRS，隨后將電轉(zhuǎn)入表皮

7、葡萄球菌1457菌株的重組質(zhì)粒在43℃條件下振搖培養(yǎng)，篩選saeRS缺失突變株，并對(duì)獲得的刪除突變株進(jìn)行PCR、測(cè)序及生物化學(xué)反應(yīng)試劑條鑒定，確證為表皮葡萄球菌1457 SaeRS缺失突變株(SE1457△saeRS)。
　　 不同的微生物宿主含有不同的復(fù)制起始子和抗性基因等，因此一種位點(diǎn)特異性的基因重組刪除基因的方法不可能適用于所有的細(xì)菌種類。在富含AT堿基的革蘭染色陽(yáng)性的表皮葡萄球菌1457中利用質(zhì)粒pMAD定向刪除基因。p

8、MAD為穿梭質(zhì)粒，可在革蘭陰性的大腸埃希桿菌和革蘭陽(yáng)性的葡萄球菌中擴(kuò)增。因?yàn)樽源竽c埃希菌中抽提質(zhì)粒方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)流程往往是在大腸埃希菌中擴(kuò)增pMAD重組質(zhì)粒后，再導(dǎo)入葡萄球菌。然而表皮葡萄球菌細(xì)胞不接受直接來(lái)自革蘭陰性桿菌的質(zhì)粒，而金黃色葡萄球菌RN4220是一種缺陷型革蘭陽(yáng)性菌，可以接受來(lái)自革蘭陰性菌的質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在金黃色葡萄球菌RN4220中經(jīng)過(guò)宿主菌的修飾后即可被表皮葡萄球菌細(xì)胞接受。本研究以雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)為目的基因，采用載

9、體pMAD構(gòu)建重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)表皮葡萄球菌1457，篩選突變株。pMAD篩選方法簡(jiǎn)便高效，只需一步篩選過(guò)程就可得到突變株，但pMAD質(zhì)粒較大(9.66 kb)，含多克隆位點(diǎn)較少，重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化比較困難。
　　 第二章表皮葡萄球菌saeRS基因刪除株生物學(xué)表型的研究為觀察saeRS刪除對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響，我們采用細(xì)菌生物膜微量板半定量方法檢測(cè)saeRS刪除突變對(duì)細(xì)菌生物被膜形成的影響，結(jié)果表明SE1457△saeRS株形成

10、生物被膜的能力明顯高于野生株。細(xì)菌初始黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生株和SE1457△saeRS株黏附到多聚物材料表面的能力，結(jié)果表明野生株和SE1457△saeRS株黏附到多聚物表面的能力沒(méi)有差異。通過(guò)檢測(cè)OD570值觀察其生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示SE1457△saeRS株與野生株的生長(zhǎng)曲線相似，saeRS基因刪除對(duì)細(xì)菌增殖無(wú)明顯影響。然而在細(xì)菌振蕩培養(yǎng)24h后檢測(cè)到SE1457△saeRS的CFU計(jì)數(shù)明顯低于野生株(大約降低logl CFU/ml)。進(jìn)

11、而采用0.25％Triton X-100誘導(dǎo)細(xì)菌自溶的方法檢測(cè)SE1457△saeRS株和野生株自溶的差異，結(jié)果顯示SE1457△saeRS株的裂解率比野生株高達(dá)50％。
　　 為更好的觀察表皮葡萄球菌形成生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)、成分分布及細(xì)菌狀態(tài)等，我們建立了激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡和透射電鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。利用這些體外培養(yǎng)系統(tǒng)可以觀察表皮葡萄球菌生物膜中的微克隆，經(jīng)各種不同熒光染料的染色后可以在激光共聚

12、焦顯微鏡下清晰的觀察到生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)部細(xì)菌的生理狀態(tài)。
　　 表皮葡萄球菌生物膜的形成及其調(diào)控是非常復(fù)雜的過(guò)程。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為兩個(gè)階段：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌初始黏附到材料表面；細(xì)菌之間互相黏附，形成多細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個(gè)階段的一些功能基因(如atlE、icaADBC、aap、bap等)，其中icaADBC編碼細(xì)胞間多糖黏附素(PolysaccharideIntercellular Adhesion，P

13、IA)，而PIA是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分之一，PIA在生物膜形成能力增強(qiáng)的SE1457△saeRS中產(chǎn)量也有明顯增加。通過(guò)SE1457△saeRS全蛋白的雙向電泳分析，我們得知Aap蛋白受SaeRS調(diào)節(jié)，提示Aap可能在SE1457△saeRS的生物膜形成中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)基因芯片以等方法，發(fā)現(xiàn)參與生物膜形成第二階段的一些基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，如phoR轉(zhuǎn)錄水平降低2.05倍。但凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)未能證明

14、SaeR可以與phoPR的啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合。
　　 第三章表皮葡萄球菌雙組分系統(tǒng)SaeRS刪除株表達(dá)譜和蛋白譜的比較分析基因芯片技術(shù)的基本原理是將大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。目前尚無(wú)商品化的表皮葡萄球菌基因芯片，本實(shí)驗(yàn)室與Genomic ResearchLaboratory(Geneva，Switzerland)及上海基因芯片公司合作，以經(jīng)過(guò)測(cè)序并

15、注釋的表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出兩千三百多個(gè)ORF的DNA片段，并制作了cDNA芯片；對(duì)于不能擴(kuò)增出DNA片段的約二百多個(gè)ORF，則合成寡核苷酸制作oligo芯片。
　　 本研究使用基因芯片對(duì)表皮葡萄球菌SE1457中的SaeRS雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)缺失后的基因表達(dá)譜的變化進(jìn)行了分析。我們獲得了一些感興趣的已知與自溶能力有關(guān)的基因，如alpQ，arlR，lytS，lrgA等。

16、經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證，上述基因的表達(dá)變化水平與芯片結(jié)果很接近。使用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)表皮葡萄球菌SE1457中的SaeRS雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)缺失后的蛋白表達(dá)譜的變化進(jìn)行了分析，我們發(fā)現(xiàn)與生物膜形成有關(guān)的Aap蛋白(SE1457△saeRS突變株中表達(dá)上調(diào)10倍)。
　　 本論文通過(guò)構(gòu)建表皮葡萄球菌SaeRS刪除株，研究SaeRS在表皮葡萄球菌中調(diào)控自溶以及生物膜形成中的作用，并通過(guò)基因芯片和蛋白組學(xué)方法研究受SaeRS調(diào)節(jié)的基