表皮葡萄球菌ica操縱子功能基因及其作為潛在藥靶的研究.pdf

1、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidia，SE)生物膜的形成導(dǎo)致細(xì)菌頑固附著于高分子醫(yī)用材料表面，難以清除，降低細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，保護(hù)細(xì)菌抵御機(jī)體天然免疫，造成慢性反復(fù)感染難以徹底治愈，手術(shù)取出植入物以徹底清除感染灶是唯一有效治療手段。因此，深入研究表皮葡萄球菌生物膜形成的相關(guān)毒力基因，對(duì)于研究其致病的分子機(jī)制并尋找有效治療藥物和方法有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室與國(guó)家人類基因組南方研究中心合作完成生物膜陰性SEATC

2、Cl2228株全基因組測(cè)序分析，通過(guò)與生物膜陽(yáng)性SEATCC35984株基因組比較發(fā)現(xiàn)，SEATCCl2228株中存在ica操縱子的缺失。李華林博士等通過(guò)基因?qū)爰夹g(shù)將ica操縱子導(dǎo)入生物膜陰性SEATCCl2228株中，使之獲得生物膜形成能力，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)生物膜的形成使SEATCCl2228株毒性加強(qiáng)，證實(shí)ica操縱子在生物膜的形成中的關(guān)鍵作用。 本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)生物膜形成SEATCC35984株ica操縱子中各

3、個(gè)基因的功能和作為新型抗菌藥靶的潛在性進(jìn)行探討，選擇／caA基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白(GT-IcaA)為首選藥物篩選靶點(diǎn)，對(duì)篩選所得候選小分子化合物生物學(xué)功能予以驗(yàn)證并初步探討其作用機(jī)制，通過(guò)同源重組基因敲除技術(shù)構(gòu)建表皮葡萄球菌icaC基因缺失突變株并研究其缺失對(duì)生物膜形成的影響及機(jī)制，嘗試?yán)么竽c桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)ica操縱子功能基因重組表達(dá)，以期為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 第一部分表皮葡萄球菌ATCC35984株ica操

4、縱子的生物信息學(xué)分析 我們運(yùn)用核苷酸和氨基酸序列比對(duì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)方法對(duì)ica操縱子的一個(gè)調(diào)節(jié)基因和4個(gè)功能基因分別進(jìn)行分析并結(jié)合已報(bào)道研究結(jié)果分別探討各個(gè)基因在細(xì)菌生物膜形成中的作用及作為藥靶的潛在性。icaR基因產(chǎn)物屬于四環(huán)素家族抑制子，通過(guò)調(diào)節(jié)ica操縱子轉(zhuǎn)錄參與環(huán)境因素等對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響，N端DNA結(jié)合區(qū)序列與家族成員高度同源，通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和比較發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)特征一致。其作用機(jī)制為與相關(guān)

5、因子結(jié)合導(dǎo)致IcaR蛋白二聚體構(gòu)象改變，無(wú)法與／ca操縱子功能基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)結(jié)合而起始轉(zhuǎn)錄，不宜作為藥物篩選靶點(diǎn)。／caA基因編碼產(chǎn)物含糖基轉(zhuǎn)移酶家族2(GlycosyltransferaseFamily2，GT2)結(jié)構(gòu)域，盡管序列間同源性較差，但經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、比較發(fā)現(xiàn)存在相似的結(jié)構(gòu)特征，并在相應(yīng)位置定位得到功能相關(guān)DXDmotif。icad編碼產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶活性必需蛋白，但是序列分析未發(fā)現(xiàn)存在已知功能結(jié)構(gòu)域，因而尚無(wú)法了解作用機(jī)制

6、。兩個(gè)蛋白協(xié)同表現(xiàn)酶活性是目前糖基轉(zhuǎn)移酶家族中所特有，且其基因編碼產(chǎn)物催化合成的p．1,6-N-乙酰葡糖胺較為少見(jiàn)，因此GT-IcaA具有作為藥物篩選靶點(diǎn)潛在性。icaB基因編碼產(chǎn)物含脫乙?；附Y(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與比較分析發(fā)現(xiàn)雖然具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但是僅在相應(yīng)位置定位得到2個(gè)完全一致的功能相關(guān)保守氨基酸位點(diǎn)。icaB基因編碼產(chǎn)物參與多糖粘附因子(Polysaccharideintercellularadhesion，PIA)糖鏈修飾

7、并影響其生物學(xué)功能，且是ica操縱子功能基因產(chǎn)物中唯一的分泌蛋白，具有作為藥物篩選靶點(diǎn)潛在性。icaC基因編碼產(chǎn)物是形成長(zhǎng)鏈多糖粘附因子糖鏈所必須，功能未知。序列比對(duì)分析未發(fā)現(xiàn)存在已知功能結(jié)構(gòu)域，無(wú)法了解其作用機(jī)制，不宜作為藥物篩選靶點(diǎn)。 綜合生物信息學(xué)分析結(jié)果，GT-IcaA和IcaB脫乙酰基酶結(jié)構(gòu)域都具有藥物篩選靶點(diǎn)的潛在性。鑒于icaA編碼產(chǎn)物是多糖粘附因子糖鏈合成的關(guān)鍵，也是IcaB編碼產(chǎn)物發(fā)揮其糖鏈修飾功能的前提，我們

8、首選GT-IcaA蛋白為藥物篩選靶點(diǎn)。 第二部分GT-IcaA蛋白作為潛在抗菌藥靶的研究 在通過(guò)第一部分的生物信息學(xué)分析，選定SEATCC35984株GT4caA蛋白為首選藥物篩選靶點(diǎn)后，我們與中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所合作，對(duì)GT-IcaA蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模建及虛擬高通量篩選小分子化合物，并最終購(gòu)得63個(gè)候選小分子化合物。 經(jīng)過(guò)最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)(MinimalInhibitoryConcentration，MIC

9、)、最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)(MinimalBactericidalConcentration，MBc)和生物膜半定量檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，63個(gè)候選小分子化合物中，4個(gè)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)(13＃、20＃、25＃、30＃)；8個(gè)單純抑制細(xì)菌生物膜形成(1＃、5＃、10＃、11＃、23＃、28＃、35＃、41＃)；并且其中3個(gè)(20＃、30＃、1＃)可影響成熟細(xì)菌生物膜，降低生物膜中的細(xì)菌。在上述12個(gè)小分子抑制物中，3個(gè)(5＃、10＃、28＃)對(duì)Vero(

10、綠猴腎細(xì)胞系)毒性較小，其它毒性較大。通過(guò)WGA植物凝集素(Lectin)結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多糖粘附因子組成N．乙酰-β-D-葡萄糖胺，發(fā)現(xiàn)l＃、l＃、11＃和23＃小分子抑制物處理后，N-乙酰-β-D-葡萄糖胺含量低于對(duì)照組。嘗試運(yùn)用高效液相色譜聯(lián)用熒光檢測(cè)器建立體外檢測(cè)糖基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，以期更直接研究上述GT-IcaA潛在小分子抑制物作用機(jī)制，但尚未成功，體外檢測(cè)糖基轉(zhuǎn)移酶活性的方法還有待繼續(xù)改進(jìn)。 第三部分表皮葡萄球菌145

11、7icac基因突變株的構(gòu)建及其對(duì)生物膜形成的影響 表皮葡萄球菌ica操縱子功能基因編碼產(chǎn)物參與合成多糖粘附因子，其中icaC基因是形成長(zhǎng)鏈多糖的必需基因，但不影響糖基轉(zhuǎn)移酶活性，其功能至今尚未見(jiàn)報(bào)道。 我們采用大腸桿菌一表皮葡萄球菌穿梭質(zhì)粒pBT2，首先于大腸桿菌DH5a中構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，將icaC基因上、下游序列接入pBT2載體中，并于上、下游序列間插入紅霉素抗性基因(ermB)作為突變株篩選標(biāo)記。然后將構(gòu)建所得并經(jīng)

12、金黃色葡萄球菌(Staphlylococcusaureus，S.aureus)RN4220株修飾的同源重組質(zhì)粒pBT2.AicaC轉(zhuǎn)化入SEl457株，利用質(zhì)粒高溫下存在復(fù)制缺陷等特性，經(jīng)過(guò)于低濃度紅霉素及40℃條件下連續(xù)傳代40天，通過(guò)抗性篩選得到SEl457icaC基因敲除突變株(SEl457Z～icaC株)，并對(duì)SEl457zS～icaC株進(jìn)行PCR和基因重組區(qū)測(cè)序等方法驗(yàn)證。比較SE1457株和AicaC株，發(fā)現(xiàn)icaC基因的缺

13、失對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和生化反應(yīng)無(wú)明顯影響，但使生物膜形成明顯降低，并且通過(guò)采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)MichealOtto博士惠贈(zèng)的兔抗表皮葡萄球菌多糖粘附因子抗血清斑點(diǎn)免疫印跡法和WGA植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)野生株和AicaC株細(xì)菌細(xì)胞外洗脫物中多糖粘附因子和N．乙酰-β-D-葡萄糖胺的含量，發(fā)現(xiàn)在AicaC株中均降低。 第四部分表皮葡萄球菌ATCC35984株ica操縱子功能基因的重組表達(dá) 隨著上述三部分研究的進(jìn)行

14、，我們嘗試?yán)么竽c桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)／ca操縱子功能基因進(jìn)行重組表達(dá)，以期得到純化蛋白，為深入研究其功能機(jī)制提供幫助。 我們選用了pET28-a、pQE-8lL、pMAL-c2X及pBAD／TOPO(R)ThioFusion四種原核表達(dá)載體，分別構(gòu)建／ca操縱子功能基因表達(dá)質(zhì)粒。最終得到／caA(A-pET、A-pMAL、A-pBAD)、／caA糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(GT-icaA)(GT-icaA—pET、GT-icaA—pQE、

15、GT-icaA—pMAL、GT-icaA—pBAD)、icad(D-pET、D-pMAL、D-pBAD)、icaB(B-pBAD)和icaC(C-pET)共12個(gè)表達(dá)質(zhì)粒，但是僅GT-／caA-pMAL和GT-icaA-pBAD表達(dá)質(zhì)粒可在大腸桿菌中被誘導(dǎo)表達(dá)，得到目的蛋白。利用麥芽糖結(jié)合蛋白(MaltoseBindingProtein，MBP)可與多糖樹(shù)脂(AmyloseResin)結(jié)合并被麥芽糖置換地特性，純化得到MBP-GT-Ic