金黃色葡萄球菌fur基因缺失株構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、目的：探究鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白fur對(duì)金黃色葡萄球菌體外增殖活性試驗(yàn)、溶血活性、體外侵襲力以及毒力基因、代謝和耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明fur在調(diào)控金黃色葡萄球菌致病性中的作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴fur基因缺失株的構(gòu)建：以金黃色葡萄球菌Newman株為研究對(duì)象，通過(guò)基因同源重組技術(shù)構(gòu)建fur基因缺失株，并進(jìn)行鑒定。⑵采用體外增殖活性試驗(yàn)，觀察野生株、fur基因缺失株之間生長(zhǎng)速率的差異。⑶采用抗生素保護(hù)試驗(yàn)，比較Ne

2、wman野生株、fur基因缺失株之間體外侵襲力的差異。⑷采用溶血活性試驗(yàn)，觀察Newman野生株、fur基因缺失株之間溶血活性差異5.提取Newman野生株和fur基因缺失株全基因組RNA進(jìn)行RNA測(cè)序，觀察野生株和缺失株之間毒力基因、代謝和耐藥相關(guān)基因表達(dá)特征的差異。
　　結(jié)果：①通過(guò)構(gòu)建T載體并與pKOR1質(zhì)粒進(jìn)行連接，成功構(gòu)建分子量大小為2000bp的過(guò)渡質(zhì)粒，進(jìn)一步經(jīng)后續(xù)抗生素抗性篩選獲得fur基因缺失株，并經(jīng)基因測(cè)序得到

3、驗(yàn)證。②體外增殖活性試驗(yàn)：觀察到野生株2h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，8h后進(jìn)入平臺(tái)期。在體外培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、10h和12h， Newman野生株的增殖率均明顯高于缺失株（P＜0.05）。③萬(wàn)古霉素保護(hù)試驗(yàn)：Newman野生株對(duì)A549細(xì)胞株的侵襲能力明顯高于fur基因缺失株（t=4.124,P=0.001＜0.05）。4.溶血活性試驗(yàn):Newman野生株的溶血活性明顯強(qiáng)于fur基因缺失株；④RNA測(cè)序：缺失株與野生株相比，上調(diào)

4、基因169個(gè)，下調(diào)基因313個(gè)，其中毒力基因clfA、capA、capB、capC、capD、capP、ebpS、lytM等上調(diào)，hla、lukF、lukS、hlgA、hlgB、hlgC、clfB、fnbA、fnbB等下調(diào)。
　　結(jié)論：⑴金黃色葡萄球菌Newman野生株體外增殖活性、溶血活性和體外侵襲力明顯高于fur基因缺失株，提示fur對(duì)金黃色葡萄球菌多種生物學(xué)具有重要調(diào)控效應(yīng)。⑵fur基因缺失株多種毒力基因、代謝和耐藥相關(guān)基因