金黃色葡萄球菌DNA疫苗的研制及其初步應(yīng)用.pdf

1、乳房炎是奶牛的一種多發(fā)病和常見病，嚴(yán)重引發(fā)奶牛體況下降、產(chǎn)奶量下降，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)導(dǎo)致奶品質(zhì)量降低，致病菌還構(gòu)成食品安全的潛在威脅。針對(duì)奶牛乳房炎的主要致病菌-金黃色葡萄球菌(金葡菌)進(jìn)行了多年的防治工作，但迄今仍未獲得安全有效的奶牛乳房炎疫苗。 本課題目的：利用分子佐劑牛C3d改造真核表達(dá)載體，同時(shí)針對(duì)金葡菌奶牛乳房炎的感染機(jī)制選擇多種保守性的關(guān)鍵抗原靶位基因，構(gòu)建免疫增強(qiáng)型重組金葡菌DNA疫苗，經(jīng)免疫接種小鼠動(dòng)物模

2、型，考察疫苗的體液免疫，細(xì)胞免疫效果及其免疫保護(hù)作用，探討其作為金葡菌奶牛乳房炎防治疫苗的可行性。 通過分離、克隆并重組牛C3d基因，成功構(gòu)建新穎的免疫增強(qiáng)型真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-C3d3，同時(shí)分離和克隆金葡菌抗原靶位基因ClfA、FnBP、TRAP(后二者融合為Minigene)，利用二種真核表達(dá)載體共成功構(gòu)建四種DNA疫苗(pcDNA3.1(+)-ClfA，pcDNA3.1(+)-Minigene，pcDNA3

3、.1(+)-ClfA-C3d3，pcDNA3.1(+)-Minigene-C3d3)。免疫接種小鼠動(dòng)物模型結(jié)果顯示，四種DNA疫苗都能成功激發(fā)小鼠產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)(抗體效價(jià)分別為3200，3200，6400，和6400)和細(xì)胞免疫反應(yīng)(SI值分別為1.521±0.3267，1.682±0.2542，1.813±0.2567和2.021±0.2282)，其中增強(qiáng)型DNA疫苗的免疫效果均強(qiáng)于對(duì)照組(體液免疫增強(qiáng)約100％；細(xì)胞免疫增強(qiáng)約20

4、％)，同時(shí)攻毒實(shí)驗(yàn)初步顯示其免疫保護(hù)的作用。上述結(jié)果提示，構(gòu)建的DNA疫苗不僅可作為預(yù)防性疫苗，而且可能發(fā)展為治療性疫苗。 利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a(+)獲得純度為95％的新型重組蛋白疫苗Trx-Minigene和Trx-ClfA(表達(dá)產(chǎn)量分別為178.5mg/L和80.6 mg/L)，免疫小鼠獲得高滴度的特異性抗體(最高抗體效價(jià)均達(dá)到819200)，結(jié)果表明可能成為良好的候選金葡菌預(yù)防性疫苗。上述工作為蛋白疫苗與DNA疫苗