金黃色葡萄球菌腸毒素B適配子的篩選及初步應用.pdf

1、目的：以金黃色葡萄球菌腸毒素B為靶物質篩選獲得的富集單鏈DNA文庫為起始文庫，從中篩選獲得能高親和力和高特異性結合金黃色葡萄球菌腸毒素B的單個DNA適配子，并利用適配子建立的夾心法檢測患者血清標本中SEB的含量，輔助診斷金黃色葡萄球菌感染；同時研究適配子在大鼠體內(nèi)對SEB超抗原活性的抑制作用。
　　 方法：⑴將富集文庫的篩選產(chǎn)物分別進行擴增、純化、膠回收和TA克隆轉化至大腸桿菌DH5α中，LB液體增菌保存。挑取單個菌落培養(yǎng)，作為

2、菌種保存，抽提質粒，利用相應引物進行PCR擴增，并以羧基磁珠作為分離介質獲得單個適配子。⑵分別利用地高辛、熒光素和生物素標記的適配子直接測試法，對適配子的結合率和特異性等性質進行鑒定。⑶分別采用抗體一適配子夾心法和文庫一適配子夾心法，用于SEB的定量檢測；同時對兩種檢測方法進行比對。利用文庫一適配子夾心法檢測臨床患者血清中SEB的含量。⑷將大鼠隨機分成4組，分別進行不同的干預和處理；隨后檢測各組大鼠血清中IL-4，IL-6，ALT，AS

3、T，肌酐和尿酸的含量，并對各組檢測結果進行分析。
　　 結果：①篩選產(chǎn)物進行克隆和增菌培養(yǎng)后，選擇其中40個克隆子進行了檢測，共獲得了30個條帶位置正確的適配子，并從中篩選得到了一條結合力和特異性均較好的適配子。②文庫一適配子夾心法和抗體一適配子夾心法均可用于SEB的檢測，且兩種檢測方法的結果無統(tǒng)計學差異。而健康對照組與細菌感染組血清標本中SEB的含量具有統(tǒng)計學差異。③適配子在大鼠體內(nèi)對SEB超抗原活性具有一定的抑制作用，可有效