金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細胞免疫優(yōu)勢表位及表位疫苗研究.pdf

1、研究背景和目的:金黃色葡萄球菌中,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染危害嚴重,目前臨床抗生素療法已法完全控制MRSA感染,疫苗研制迫在眉睫。MRSA致病能力主要取決于其產生的毒素和侵襲酶的能力,金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素(SE),是引起人類食物中毒、全身炎癥反應和膿毒癥休克的主要原因,其中 SEB在MRSA各菌株中序列相對保守,結構穩(wěn)定。在小鼠模型研究中證實,SEB具有比其他抗原更好的體液應答優(yōu)勢,人 SEB單克隆抗體可預防 M

2、RSA感染常見的毒性休克綜合癥。然而,SEB本身為毒素,用于人體存在安全隱患,因此,失去毒性的重組SEB突變子(rSEB)可能是MRSA疫苗良好的候選抗原。研究表明,SEB的免疫保護作用主要來自于抗體應答,而機體的免疫應答多集中針對免疫優(yōu)勢表位,抗原引起的保護性應答實質是特異的保護性表位的應答。因此,對SEB抗原中保護性免疫優(yōu)勢表位的鑒定,是解析MRSA感染中SEB應答的具體機制和優(yōu)化基于SEB的MRSA疫苗設計的重要前提。
　　

3、目前已報道的SEB的B細胞表位的研究較少,對SEB的免疫優(yōu)勢的B細胞表位的全面分析尚未見報道,基于SEB免疫優(yōu)勢表位的疫苗研究也未見報道。本課題目的是系統(tǒng)篩選并鑒定SEB的B細胞免疫優(yōu)勢表位,并分析相應優(yōu)勢表位的生物學功能;構建并表達涵蓋SEB的免疫優(yōu)勢及亞優(yōu)勢B細胞表位的多表位融合蛋白疫苗,并評價其在抗MRSA感染中的保護作用。
　　方法:
　　第一部分: SEB的B細胞免疫優(yōu)勢表位篩選及其功能鑒定
　　1.因SEB

4、毒性與其超抗原活性密切相關,為評價重組SEB突變子(rSEB)的毒性,用不同濃度的 rSEB或天然 SEB毒素分別刺激 BALB/c小鼠脾淋巴細胞,分析 rSEB刺激T細胞異常增殖及刺激脾淋巴細胞分泌IL-2,IFN-γ及TNF-α的能力。
　　2.用AlPO4佐劑輔助SEB突變子( rSEB)免疫BALB/c小鼠,在三次免疫之后進行MRSA252菌株的尾靜脈攻毒實驗,分析rSEB蛋白疫苗在預防MRSA252感染中的效果,并采集r

5、SEB免疫后小鼠的血清,分析血清中SEB抗體效價,評價SEB抗體應答在MRSA感染中的作用。
　　3.合成覆蓋SEB全長的42條重疊18-肽,以上步獲得的SEB抗血清為一抗,用肽ELISA法分析各個重疊18-肽與SEB的結合能力,系統(tǒng)篩選與SEB具有優(yōu)勢結合能力的線性B細胞表位肽。以SEB全蛋白作為陽性對照,以無關肽OVA192-201和無關蛋白BSA作為陰性對照。用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0作非配對T檢驗來分析各個吸光度值。

6、r>　　4.在弗氏佐劑輔助下,用免疫優(yōu)勢18-肽-KLH的偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠,經三次免疫后獲得表位肽抗血清。以 SEB天然毒素為包被抗原,用間接 ELISA法檢測不同稀釋度的表位特異性抗血清與SEB天然毒素的結合能力。
　　5.針對每個已篩選出的SEB免疫優(yōu)勢表位,從N-端及C-端分別依次截斷2個氨基酸,合成多個截斷肽,分別以截斷肽為包被抗原,以相應優(yōu)勢表位肽抗血清為一抗,用間接ELISA法分析各個截斷肽與相應18-肽抗血

7、清的結合強度,明確所篩選表位的核心序列。進一步,表位肽抗血清以不同濃度稀釋,再次用ELISA法篩選與相應抗血清結合最強的截斷肽,即優(yōu)勢表位核心序列。
　　6.在動物模型中獲得表位核心序列的抗血清,在體外進行SEB毒素中和實驗,明確所篩選的SEB免疫優(yōu)勢表位的功能。在弗氏佐劑輔助下,用免疫優(yōu)勢表位核心序列-KLH偶聯(lián)物免疫 BALB/c小鼠,經末次免疫后7天獲得表位核心序列的抗血清,在體外分析該表位核心序列的抗血清阻斷SEB毒素的刺

8、激T細胞增殖及脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。
　　7.在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索不同金黃色葡萄球菌菌株來源的SEB氨基酸序列, NCBI網(wǎng)站上進行同源性比對,明確所篩選的SEB優(yōu)勢表位在不同金黃色葡萄球菌菌株中的序列保守性。在Pubmed protein data base數(shù)據(jù)庫中下載SEB晶體結構圖,用PyMOL1.1軟件分析SEB免疫優(yōu)勢表位在SEB晶體結構中的位置,分析SEB免疫優(yōu)勢表位在SEB

9、晶體結構中的位置。
　　8.采用肽ELISA法分析SEB優(yōu)勢表位與臨床MRSA(+)血清的交叉反應性,以此評價SEB優(yōu)勢表位在人體中的應用前景。以SEB的優(yōu)勢表位為包被抗原以SEB抗血清為陽性對照,以臨床SEB抗體(-)血清為陰性對照。
　　第二部分:SEB的多表位疫苗制備及其保護功能評價
　　1.利用基因工程技術構建含 SEB優(yōu)勢表位及亞優(yōu)勢表位的疫苗蛋白的原核表達質粒,并在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達重組 S

10、EB多表位融合蛋白;用 SDS-PAGE鑒定蛋白該表達形式;用Western Blot分析該蛋白的免疫原性及免疫反應性;經離子交換層析純化該蛋白;對蛋白進行進行N端氨基酸測序;用BCA法檢測蛋白濃度。
　　2.分別在弗氏佐劑及AlPO4佐劑輔助下,用SEB多表位蛋白或rSEB免疫BALB/c小鼠,三次免疫后經尾靜脈對小鼠進行 MRSA252菌株攻毒,分析不同免疫組小鼠在MRSA252感染后14天的生存狀態(tài),評價該疫苗對小鼠抗金黃色

11、葡萄球菌感染的保護效果。
　　3.用ELISA法檢測小鼠的抗血清滴度,分析各組疫苗免疫后特異性抗體的效價。ELISA法檢測SEB多表位疫苗的血清中抗SEBIgG抗體的水平,評價SEB多表位疫苗抗體應答在中和SEB毒素中的作用。分別以疫苗中的各個表位為包被抗原,ELISA法檢測疫苗的抗血清與疫苗中每個表位的結合強度,評價疫苗中每個表位特異性抗體的應答水平。
　　4.無菌收集不同免疫組存活小鼠的心、肝、肺及腎臟,研磨獲得各臟器組

12、織的懸液,選用生理鹽水作不同稀釋度稀釋,進行細菌涂板,通過菌落計數(shù)、革蘭染色及PCR法計算各臟器中MRSA252的數(shù)量,評價在免疫攻毒后小鼠各臟器中細菌的定植量。
　　結果:
　　第一部分:SEB的B細胞免疫優(yōu)勢表位篩選及其功能鑒定
　　1.SEB突變子(rSEB)失去了SEB天然毒素的超抗原活性,不能刺激T細胞異常增殖,也不能刺激脾淋巴細胞分泌高水平的細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α。
　　2.用AlP

13、O4佐劑輔助rSEB免疫BALB/c小鼠,獲得了預防MRSA252感染的效果,產生了高水平的針對天然SEB的抗體。小鼠存活率達80％,顯著高于AlPO4佐劑組(20%)及PBS組(全部死亡)。免疫后血清中SEB抗體平均效價高達1:64000,顯著高于AlPO4佐劑組及PBS組。
　　3.在SEB的應答中,IgG抗體應答主要集中針對其中三個免疫優(yōu)勢B細胞18-肽,包括SEB97-114(NKNIDLFGTNYYYQCYFS), SE

14、B205-222(YETGYIKFIEGNGHSFWY)及SEB247-261(VESKSINVEVHLTKK)。其中SEB97–114及SEB247-261分別含有已報道表位SEB252-261(INVEVHLTKK)和SEB96-103(KNKNIDLF),因此,SEB205-222為本研究新發(fā)現(xiàn)的表位。
　　4.與正常血清作對照,SEB的三個優(yōu)勢表位肽特異性抗血清在不同稀釋度下,均能高效與SEB天然毒素進行反應(P<0.05

15、),尤其在抗血清稀釋度為1:1000和1:2000時最顯著(P<0.01)。
　　5.經截斷肽ELISA及抗血清的濃度滴定法進一步檢測,在SEB97–114組截斷肽中, SEB97–112相比其他截斷肽與 Anti-SEB97–114的結合能力最強;在 SEB205–222組截斷肽中,SEB205–222相比其他截斷肽與 Anti-SEB205–222的結合能力最強;在SEB247–261組截斷肽中,SEB247–261相比其他截

16、斷肽與 Anti-SEB247–261的結合能力最強。因此,免疫優(yōu)勢表位 SEB97–114、SEB205-222及 SEB247-261的核心序列分別為SEB97–112、 SEB207-222及SEB247-257。
　　6.在體外,SEB三個免疫優(yōu)勢表位的抗血清Anti-SEB97–114、Anti-SEB205-222及Anti-SEB247-261均可中和天然SEB毒素的刺激T細胞異常增殖及刺激脾淋巴細胞分泌高水平的細胞

17、因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的能力。
　　7.同源性分析顯示,SEB97–112及SEB207-222氨基酸序列保守,SEB247-257氨基酸序列非保守;三維晶體結構圖中顯示,SEB97–112位于SEB內部的Loop區(qū),SEB207-222及SEB247-257SEB外部的β-片層。
　　8.SEB97-112與14/14的人MRSA(+)血清有交叉反應,SEB207-222與13/14的人MRSA(+)血清有交

18、叉反應,SEB247-257與14/14的人MRSA(+)血清有交叉反應。
　　第二部分:SEB的多表位疫苗制備及其保護功能評價
　　1.構建并獲得了含 SEB三個優(yōu)勢表位及三個亞優(yōu)勢表位的 SEB多表位融合蛋白。經鑒定,該蛋白為包涵體表達,經純化后的蛋白純度大于95%,SEB多表位融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反應性, SEB多表位融合蛋白的N端氨基酸序列與目的蛋白一致。經純化的SEB多表位融合蛋白濃度為2.924 mg

19、/mL。
　　2.分別在弗氏佐劑及AlPO4佐劑輔助下,用SEB多表位融合蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫三次后小鼠獲得了對 MRSA252的抗感染保護能力。SEB多表位融合蛋白疫苗組的免疫保護效果優(yōu)于 rSEB全抗原組的免疫保護效果,尤其在 AlPO4佐劑輔助下,表位疫苗組小鼠抗MRSA252感染的存活率高達100%。
　　3.SEB多表位融合蛋白疫苗誘導小鼠產生了高效價的抗體,特別是在AlPO4佐劑下,SEB多表位融合

20、蛋白疫苗組產生的抗體平均效價高達1:736000。SEB多表位融合蛋白疫苗誘導小鼠產生的抗體能夠識別天然SEB毒素,在不同佐劑輔助時,SEB多表位疫苗產生的抗SEB IgG抗體水平有差異。該SEB多表位融合蛋白疫苗誘導小鼠產生的抗體在不同程度上特異性地識別了各個表位,且各個表位的協(xié)同可能發(fā)揮更好的抗MRSA感染的作用。
　　4.免疫攻毒后,存活小鼠的各個臟器中,腎臟定植的MRSA細菌量顯著高于心、肝、肺。經統(tǒng)計學分析,小鼠抗MRS

21、A感染存活率與各個臟器細菌定植量成負相關。
　　結論:
　　本實驗通過重疊肽ELISA、B細胞表位特異性抗體的中和毒素活性試驗、抗原表位的生物信息學及臨床血清學分析,篩選并鑒定出了SEB的三個免疫優(yōu)勢應答B(yǎng)細胞表位,揭示了SEB體液免疫在抗MRSA感染中的保護機制,不僅發(fā)現(xiàn)了SEB的新表位SEB207-222,而且揭示了已報道的SEB表位的核心序列SEB97-112及SEB247-257。通過基因工程技術構建并獲得了SEB多