金黃色葡萄球菌B型腸毒素的溶液構象及菌體生長環(huán)境效應.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Saphylococcusaureus)是人類和某些動物的病原菌之一，其致病力強弱主要取決于產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶的能力，其中金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素，是引起人類食物中毒和葡萄球菌胃腸炎的主要原因，因此，這方面的研究已成為科學家們普遍關注的重要課題。本文以主要產(chǎn)B型腸毒素的金黃色葡萄球菌S6菌株為研究對象，采用X-射線衍射、掃描電鏡、原子力顯微鏡、分子振動光譜(紅外、激光拉曼)、圓二色譜、熒光光譜等現(xiàn)代分析技術表征金黃色

2、葡萄球菌B型腸毒素(staphylococcalenterotoxinB，簡稱SEB)的聚集態(tài)結構、三維立體形貌、分子鏈構象及蛋白質二級結構組成。同時著重研究了腸毒素在稀溶液狀態(tài)和外界環(huán)境改變時的構象特征及可能的去折疊過程，嘗試用蛋白質構象理論揭示腸毒素耐熱的根本原因，尋找其耐熱的可能優(yōu)勢構象，建立研究蛋白質構象與生物學活性相關性的新方法。此外，還從酸奶發(fā)酵菌株和金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)特性出發(fā)，研究了乳酸菌及代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的

3、抑制作用及其在抑制過程中熱效應的微量變化，從熱化學的角度探討其作用機制。主要研究結果如下： 1.金黃色葡萄球菌B型腸毒素的分離純化采用玻璃紙覆蓋瓊脂平板法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，首先利用羧甲基纖維素陽離子CM-32柱層析，對B型腸毒素進行初步分離富集，然后依據(jù)篩分原理按分子量大小經(jīng)SephadexG-75凝膠進一步純化，得到電泳純B型腸毒素，得率為26.8％，紫外吸收光譜測得其特征吸收峰為276.6nm，SDS-PAGE凝膠電泳分析

4、其相對分子質量為2.8×104，與文獻報道值一致。 2.金黃色葡萄球菌B型腸毒素的結構表征利用X-射線衍射、掃描電鏡、原子力顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、激光拉曼光譜等現(xiàn)代分析手段對金黃色葡萄球菌B型腸毒素的聚集態(tài)結構、分子鏈形態(tài)，二級結構等進行了表征。結果表明，SEB為一種單純蛋白，其聚集態(tài)包含結晶區(qū)和無定形區(qū)，結晶度為37.8％，其分子聚集在一起，形態(tài)主要為片狀和平板狀，具有一定的規(guī)整性。原子力顯微鏡首次觀察到SEB在稀溶液狀

5、態(tài)下的單分子鏈長度約為1500nm，分子鏈寬度約為20～40nm，分子鏈高0.6nm。SEB的傅里葉變換紅外光譜和激光拉曼光譜分析表明，SEB的二級結構單元主要為B-折疊和α-螺旋，無規(guī)卷曲含量較少，側鏈C-C-S-S-C-C構型為反式－扭曲－反式。 3.金黃色葡萄球菌B型腸毒素的稀溶液構象及去折疊作用研究大分子的溶液構象和蛋白質的去折疊作用是近來揭示蛋白質生物活性及其與高級結構相關性的重要切入點。金黃色葡萄球菌B型腸毒素水溶液

6、(濃度為0.02mol/L)在25℃的遠紫外CD譜顯示，其二級結構各構象單元含量分別為：α-螺旋22.6％、β-折疊40.4％、轉角19.2％和無規(guī)卷曲17.7％，說明SEB屬于β-折疊含量較高的蛋白質。在50～121℃溫度范圍內，隨著溫度的升高，SEB二級結構中的α-螺旋含量逐漸下降，從25℃時的22.6％降為95℃的9.6％，在121℃時，α-螺旋完全消失。同SEB二級結構中α-螺旋變化相反，β-折疊含量則相對保持穩(wěn)定，僅在75℃時

7、其含量為8.5％，而在其它溫度處理下，含量均在30.2％以上，121℃時仍保持39.9％，溫度變化(除了75℃外)幾乎不能引起SEB去折疊，由此說明β-折疊是保持SEB二級結構穩(wěn)定性的優(yōu)勢構象單元。SEB經(jīng)121℃處理后的激光拉曼光譜顯示，表征其二級結構的α-螺旋和二硫鍵譜帶消失，而在1672cm-1處仍保持β-折疊的特征譜帶，同樣證實SEB是一種熱穩(wěn)定性強的蛋白質，從分子水平探討了腸毒素熱穩(wěn)定性的機理，這一結論未見文獻報道。

8、本實驗通過CD和熒光光譜分析研究了SDS、脲和乳酸鏈球菌素對稀溶液中SEB構象的影響。實驗表明，SDS和乳酸鏈球菌素均能使SEB構象單元中的α-螺旋含量下降，B-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，但仍然保持β-折疊的主導結構，說明SDS和乳酸鏈球菌素對SEB不具有減毒或滅活作用。脲的作用相反，它能使SEB二級結構中的α-螺旋構象單元的含量顯著增加，而β-折疊和無規(guī)則卷曲消失，轉化為轉角結構，起到去折疊的作用，從而證實了脲處理并不能使變性的腸毒素

9、恢復活性而有利于檢測這一推測。 熒光光譜研究表明，在不同濃度脲的作用下(脲濃度依次為0、0.1、1、2、3、4、5、6mol/L)，隨著脲濃度的增加，SEB分子中的Trp進入疏水環(huán)境，熒光量子產(chǎn)率降低，熒光強度減弱；而在不同濃度SDS和乳酸鏈球菌素作用下，隨著SDS和乳酸鏈球菌數(shù)濃度的增加，SEB分子中的Trp進入親水環(huán)境，熒光強度增強。30％乙醇和30％甘油分別使SEB內源熒光強度增強29.9％和461.0％，最大發(fā)射波長保持

10、不變，其作用效果和SDS一致。SEB對Nisin熒光光譜影響不大，Nisin熒光光譜的最大發(fā)射峰位置基本沒有發(fā)生變化，相對熒光強度僅有微弱的增強，說明SEB與Nisin相互作用時，僅有較小的能量轉移。 4.金黃色葡萄球菌B型腸毒素抗體的制備及間接競爭ELISA檢測方法的建立以Balb/c小鼠為免疫對象，采用小劑量長周期免疫方案，多點多次注射金黃色葡萄球菌B型腸毒素，待小鼠血清效價達到要求后，腹腔注射P2/0骨髓瘤細胞抽取腹水制備

11、抗體，間接ELISA測定抗體效價可達1：105左右，具有實際應用價值。 以自制抗原和抗體建立的金黃色葡萄球菌B型腸毒素間接競爭ELISA方法的最低檢測量為1ng/mL，線性檢測范圍為1～103ng/mL，相關系數(shù)R2=0.9951，對人工污染樣品的平均回收率為94.5％。 5.乳酸菌及代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑制作用的研究乳酸菌及代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑制作用研究表明，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時

12、，由于環(huán)境pH值的降低、抗微生物因子的存在及微生物之間的營養(yǎng)競爭作用，使得金黃色葡萄球菌的生長受到了抑制。乳酸、乙酸和過氧化氫均對金黃色葡萄球菌的生長有較強的抑制作用，且隨著含量的增加，抑制作用增強。乳酸和乙酸對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于無機酸(鹽酸)，pH3.5時，三種酸均可顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長。乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的抑制作用與濃度呈正相關，y=0.8025x+5.12，R2=0.9939。 6.乳酸鏈球菌素

13、對金黃色葡萄球菌抑制作用的微量熱學研究首次采用微量熱法研究乳酸鏈球菌素(Nisin)對金黃色葡萄球菌的抑制作用。在Nisin作用下，金黃色葡萄球菌的生理、生化和代謝特征均發(fā)生了變化。結果表明，隨著Nisin濃度的增加，金黃色葡萄球菌的生長速率常數(shù)降低、傳代時間延長，且Nisin濃度越高，其作用越明顯。金黃色葡萄球菌的生長速率常數(shù)(k)和Nisin的濃度(c)之間的關系式為k=0.0377-3.988×10-4c，R=-0.9971，Ni

14、sin對金黃色葡萄球菌的半數(shù)抑制濃度為48.05IU/mL，金黃色葡萄球菌的臨界生長濃度值為94.53IU/mL。微量熱法所反映的生長速率常數(shù)、傳代時間、半數(shù)抑制濃度和臨界生長濃度值均可作為評價Nisin抑菌作用的一個定量指標，同樣可用于評價其它細菌素對微生物的生物活性作用。此方面的研究尚未見文獻報道。 7.金黃色葡萄球菌在酸奶中生態(tài)學初步研究金黃色葡萄球菌在酸奶中的初步生態(tài)學研究表明，原料乳中金黃色葡萄球菌初始接種量對其生存能

15、力有決定性的影響。原料乳中金黃色葡萄球菌初始接種量分別為1.8×10、1.8×102cfu/mL時，在酸奶發(fā)酵與冷藏過程中均未檢測出金黃色葡萄球菌，且成品酸奶中金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶、腸毒素的檢測均為陰性；原料乳中金黃色葡萄球菌的接種量分別為8.5×103、2.7×104、2.7×105、1.8×106cfu/mL時，在酸奶發(fā)酵過程中，金黃色葡萄球菌菌數(shù)呈明顯上升趨勢；而冷藏過程中，金黃色葡萄球菌菌數(shù)呈逐漸下降趨勢，成品酸奶中耐熱核酸