產(chǎn)金黃色葡萄球菌腸毒素A工程菌構(gòu)建及其發(fā)酵條件研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起食物中毒和醫(yī)院化膿性感染的一種重要致病菌。其致病力的大小主要取決于其所產(chǎn)腸毒素(staphylococcalenterotoxins,SEs)的能力。SEs是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相近、抗原性不同、分子量為24-32 KDa的單鏈,且具有超抗原活性的胞外蛋白,包括腸毒素A、腸毒素B、腸毒素C等近二十種血清型。其中,以A型腸毒素(SEA)引起食物中毒的發(fā)生率最高。
　　

2、 本研究首先構(gòu)建了SEA基因重組表達(dá)菌株(E.coli BL28-rSEA),然后對(duì)其培養(yǎng)與表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,為后續(xù)大量制備SEA標(biāo)準(zhǔn)品奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下。
　　 1重組SEA工程菌的構(gòu)建與蛋白的表達(dá)、純化
　　 從野生型金葡菌ATCC13565中克隆SEA基因插入含有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET28a(+)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,成功構(gòu)建能高效表達(dá)重組SEA蛋白(recombinantstaphylococcal

3、 enterotoxin A,rSEA)的工程工菌E.coli BL28-rSEA。采用Ni-NTA HisBind Resin的親和層析方法對(duì)rSEA進(jìn)行分離純化,SDS-PAGE電泳表明BL28-rSEA產(chǎn)生的rSEA為28 KDa的融合蛋白,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。
　　 2重組SEA工程菌的發(fā)酵條件研究
　　 采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linkedimmuno

4、sorbent assay,icELISA)對(duì)rSEA產(chǎn)量進(jìn)行定量。研究了接種量、pH、溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、乳糖誘導(dǎo)濃度等對(duì)工程菌BL28-rSEA產(chǎn)rSEA的影響。結(jié)果表明,E.coli BL28-rSEA在接種量2％、pH7.0、溫度為37℃、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600約為0.6),添加終濃度為0.6 mmol/L的乳糖誘導(dǎo)7 h,能獲得10.6 mg/L的rSEA。
　　 3 rSEA工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
　　

5、 首先,采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)rSEA的工程菌E.coli BL28-rSEA培養(yǎng)基主要成份葡萄糖、蛋白胨、甘油等進(jìn)行評(píng)價(jià),然后用最陡爬坡試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成份的最適區(qū)域進(jìn)行評(píng)估,最后采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析對(duì)被測(cè)因子的最佳濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,E.coli BL28-rSEA產(chǎn)rSEA的最佳培養(yǎng)基成份為(g/L):葡萄糖2.00,蛋白胨23.00,Na2HPO4·12H2O21.00,NaH2PO4·