食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測和基因分型研究.pdf

1、目的:
　　 1建立食源性金黃色葡萄球菌14種腸毒素基因的多重PCR檢測方法，調(diào)查石家莊地區(qū)食源性金葡菌中腸毒素基因的分布狀況。
　　 2設(shè)計食源性金葡菌的MLVA分型方法，比較MLST、MLVA、PFGE三種基因分型方法在食源性金葡菌基因多樣性研究中的優(yōu)劣勢。
　　 方法:
　　 1對93株食源性金葡菌進(jìn)行復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，用試劑盒提取基因組DNA;
　　 2設(shè)計14種腸毒素基因A、B、C、D、E、

2、G、H、J、K、L、M、N、Q、U的PCR引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件確定多重PCR反應(yīng)體系，對石家莊地區(qū)分離的93株食源性金葡菌進(jìn)行腸毒素基因的檢測;
　　 3參考相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合網(wǎng)站數(shù)據(jù)設(shè)計金葡菌的MLVA分型方法。應(yīng)用MLST、MLVA、PFGE三種方法分別對26株食源性金葡菌進(jìn)行基因分型，對分型結(jié)果進(jìn)行對比分析。
　　 結(jié)果:
　　 193株食源性金葡菌均成功復(fù)蘇，提取的基因組DNA濃度和純度均符合實(shí)驗(yàn)需求。

3、r>　　 2設(shè)計的14種腸毒素基因PCR引物除SEE外，均擴(kuò)增到了目的基因片段，雙向測序結(jié)果在GeneBank上進(jìn)行BLAST比對，證實(shí)為腸毒素基因的目的片段。
　　 3設(shè)計優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系能夠成功擴(kuò)增到食源性金葡菌的腸毒素基因目的片段，經(jīng)檢測，93株食源性金葡菌中79株檢出含有腸毒素基因，腸毒素基因的檢出率為84.95％;其中檢出SEA的有55株(59.14％)，SEG32株(34.41％),SEM32株(34.41

4、％),SEK25株(26.88％),SEB22株(23.66％),SEU21株(22.58％),SEN20株(21.51％),SEH16株(17.20％)，SEJ15株(16.13％)，SEC14株(15.05％)，SED13株(13.98％)，SEQ13株(13.98％)，SEL7株(7.53％);此外，57株金葡菌(61.29％)被檢出同時含有兩種或兩種以上腸毒素基因，其中有1株檢測到同時含有10種腸毒素基因，3株檢測到同時含有9種

5、，3株檢測到同時含有8種。
　　 4MLST分型將26株金葡菌分成8個ST序列型，其中ST59型11株，均來自同一起食物中毒分離獲得的菌株;ST5型5株，ST464型3株，ST7型和ST15型各2株;此外還獲得了一個新發(fā)現(xiàn)的ST序列型，已提交MLST國際數(shù)據(jù)庫進(jìn)行確認(rèn)并收錄。
　　 5設(shè)計的MLVA方法具有較好的分型力和可重復(fù)性，26株食源性金葡菌經(jīng)此方法成功分為10個基因型，其中VA05型11株，均為一起食物中毒中分離

6、的菌株，VA07型4株，VA01型、VA09型和VA10型各兩株，其他各一株。
　　 6PFGE分型將26株金葡菌分為9組共13個基因型，其中A組共11株，均為一起食物中毒中分離的菌株，B組有4個亞型共4株，C組有兩個亞型共3株，D組和E組各兩株，其他組各一株。
　　 結(jié)論:
　　 1設(shè)計的14種腸毒素基因PCR引物以及多重PCR反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性，能夠用于食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因的快速檢測。