金黃色葡萄球菌腸毒素B作為免疫佐劑的研究.pdf

1、動物疫病的頻發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成了困擾，尤其是病毒性疫病缺少有效的治療，積極的免疫預(yù)防是不可或缺的。目前畜禽用的疫苗有各種類型，包括很多新型疫苗，如亞單位疫苗，重組疫苗和合成多肽疫苗等，但此類疫苗免疫原性較弱，單獨(dú)免疫難以達(dá)到有效的免疫效果，開發(fā)活性高而副作用低的新型免疫佐劑的研究日益迫切。
　　 佐劑是指與抗原同時(shí)或預(yù)先應(yīng)用，能增強(qiáng)機(jī)體針對抗原的免疫應(yīng)答能力，提高免疫效果的物質(zhì)；目前研究的佐劑有上百種，其功能主要是增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)答、

2、減少抗原接種劑量和接種次數(shù)、促進(jìn)疫苗在免疫應(yīng)答能力弱的群體中的免疫效果、加快免疫應(yīng)答的速度和延長持續(xù)時(shí)間等，具備這種免疫功能的物質(zhì)都有成為免疫佐劑的潛力。
　　 金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素B(SEB)是一種具有超抗原性質(zhì)的外毒素，具有MHC結(jié)合的非限制性；可激活外周血T細(xì)胞，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞以及刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TFN-α和活化Th1細(xì)胞等功效。能夠刺激T細(xì)胞活性，提高機(jī)體免疫水平，尤其是細(xì)胞免疫水平。SEB非特異性地激活免疫細(xì)胞，引

3、起眾多細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力使其具備成為免疫佐劑的潛力。本課題的研究內(nèi)容主要包括：
　　 1.金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)基因的克隆與表達(dá)根據(jù)SEBDNA序列設(shè)計(jì)合成了一對特異性引物，以金黃色葡萄球菌S6株基因組為模板，采用PCR方法擴(kuò)增了SEB基因并克隆到pMD18-T載體，對所得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析及序列測定，結(jié)果表明該基因全長720bp，與已報(bào)道的PM36株序列同源性達(dá)100％。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pKG-SEB和pET

4、-28a-SEB，并分別在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果分別出現(xiàn)了與預(yù)期分子量大小一致的54KD和28KD的蛋白條帶，Western-blotting分析表明表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)物均具有良好的生物學(xué)活性，為今后進(jìn)一步的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 2.禽流感病毒H5亞型HA1基因的原核表達(dá)將含有禽流感病毒H5亞型HA1的原核表達(dá)載體pKG-HA1在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物上清及包涵體進(jìn)

5、行SDS-PAGE電泳分析，出現(xiàn)了與預(yù)期融合蛋白GST-HA1分子量大小一致的蛋白條帶約60KD，且目的蛋白多以包涵體形式存在。
　　 3.SEB對常規(guī)商品化疫苗及亞單位疫苗免疫增強(qiáng)作用本實(shí)驗(yàn)采用幾個(gè)濃度的重組SEB和標(biāo)準(zhǔn)SEB分別與AIVH9/NDV二聯(lián)滅活苗免疫兩周齡艾維因肉雞，通過對抗體滴度及淋巴細(xì)胞活性的測定反映SEB的免疫增強(qiáng)效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示重組SEB按5μg/只的劑量免疫肉雞時(shí)有較好的免疫增強(qiáng)效果；在免疫前期SEB

6、免疫組較疫苗對照組抗體效價(jià)增長快，7d和14d時(shí)，重組SEB中劑量組抗體效價(jià)比疫苗對照組高約2.0個(gè)滴度，到28d時(shí)，仍比疫苗對照組抗體效價(jià)高約1.5個(gè)滴度，統(tǒng)計(jì)分析表明SEB免疫組的效價(jià)顯著高于疫苗對照組(P＜0.05)，重組SEB中劑量組與其他SEB免疫組的效價(jià)均有顯著差異(P＜0.05)；淋巴細(xì)胞活性在免疫后15d達(dá)最高，重組SEB中劑量組比疫苗對照組高約2.5倍，統(tǒng)計(jì)分析差異顯著(P＜0.05)，到25d時(shí)差異減小但仍顯著。

7、r>　　 將重組SEB按5μg/只的劑量分別與AIVH5滅活苗、重組蛋白GST-HA1免疫雛雞，同時(shí)設(shè)各對照組，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示重組SEB對滅活苗及重組亞單位苗的免疫都起到了增強(qiáng)效果，其中疫苗和SEB免疫組的抗體效價(jià)顯著高于疫苗免疫組和疫苗空載免疫組(P＜0.05),HA1和SEB免疫組的抗體效價(jià)也顯著高于HA1免疫組(P＜0.05)。
　　 SEB作為一種超抗原具有超強(qiáng)的免疫激活能力，本實(shí)驗(yàn)通過三次動物實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了SEB較好發(fā)揮免