利用SELEX技術(shù)篩選金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)適體的研究及應(yīng)用.pdf

1、目的:利用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，從體外合成的全長96bp其中包含60bp的隨機(jī)序列的寡核苷酸文庫中篩選出與金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)高親和力高特異性結(jié)合的適體。并利用篩選出的適體建立酶連接適體免疫吸附檢測法和膠體金標(biāo)記適體的雙適體夾心斑點(diǎn)滲濾法用于快速鑒定SEB；同時(shí)對適體在體外抑制SEB超抗原活性的功能進(jìn)行研究。 方法: 1.在體外構(gòu)建兩端為固定序列，中間為60bp的隨機(jī)序列，全長96bp的寡

2、核苷酸文庫。以SEB為靶標(biāo)，利用SELEX篩選技術(shù)，篩選出針對SEB高親和力高特異性的適體群，建立了適體標(biāo)記熒光直接檢測法(aptamer labelledfluorescence direct assay，ALFDA)進(jìn)行各輪ssDNA富集庫與SEB的結(jié)合力測定。 2.以地高辛—堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體系統(tǒng)作為橋連，間接連接酶與核酸，通過酶促底物顯色反應(yīng)測定吸光度A值，對篩選出的適體群與SEB的結(jié)合力和部分相關(guān)蛋白進(jìn)行比較

3、。同時(shí)利用該法測定了系列濃度的適體與SEB的結(jié)合力數(shù)據(jù)，通過軟件獲得解離常數(shù)Kd值進(jìn)一步鑒定了適體與靶標(biāo)的親和力。適體標(biāo)記膠體金顆粒后，以斑點(diǎn)滲濾法為基礎(chǔ)鑒定篩選出適體的特異性。 3.將第11輪篩選產(chǎn)物分別進(jìn)行擴(kuò)增、純化，TA克隆、測序并用相關(guān)軟件分析其一級和二級結(jié)構(gòu)。 4.微孔板包被抗SEB抗體作為捕獲分子，以酶橋連適體作為檢測信號建立的酶連適體免疫混合吸附法用于SEB的定量檢測。同時(shí)將針對SEB特異性適體包被在硝酸纖

4、維素膜上作為捕獲分子，以膠體金標(biāo)記的適體作為報(bào)告分子，建立了金標(biāo)雙適體夾心斑點(diǎn)滲濾法。 5.分析適體在體外對于SEB超抗原的功能學(xué)抑制作用。系列濃度的適體作用SEB后刺激人外周血單核淋巴細(xì)胞，利用MTT法測定PBMC的吸光度A值，并通過刺激指數(shù)(SI)分析增殖活性；同時(shí)利用ELISA檢測IFN-γ的分泌情況。 結(jié)果: 1.隨著篩選輪數(shù)的增加，SEB與ssDNA富集庫的結(jié)合力也顯著增高。13輪后結(jié)合力從最初的1.1

5、％上升至39.8％，提高了36倍。當(dāng)ssDNA富集庫與SEB的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到一個(gè)飽和狀態(tài)時(shí)，吸附到靶標(biāo)上的ssDNA就不再增加。 2.利用酶連接核酸的酶促顯色反應(yīng)測定A值，鑒定適體與SEB的結(jié)合能力，結(jié)果顯示篩選出的適體與SEB反應(yīng)后的吸光度值為1.02，明顯高于SPA的0.35、BSA的0.32，和空白對照0.28。通過軟件分析，適體與SEB的解離常數(shù)Kd值可低至21.9nM。金標(biāo)適體能夠特異性識別結(jié)合SEB，膜上呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，

6、結(jié)果與酶連接核酸結(jié)果相符合。 3.11輪產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)25個(gè)測定序列中有兩對序列明顯富集，幾乎完全一致，同源性達(dá)95％以上，利用Chromas和DNAman軟件進(jìn)行序列分析一級結(jié)構(gòu)，按照同源性分成7個(gè)家族，利用DINAMelt sever軟件分別模擬出7個(gè)家族的二級結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)、G—四聚體為主。 4.建立了酶連接適體免疫吸附混合檢測法用于測定SEB的定量檢測，當(dāng)SEB濃度在0.1～20ug/ml具有

7、較好的線性關(guān)系。利用雙適體夾心斑點(diǎn)滲濾法對SEB進(jìn)行定性檢測，SEB被特異性適體捕獲后，與金標(biāo)適體反應(yīng)膜上可出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，而SPA、BSA、正常血清和空白對照均無顏色變化。 5.適體在體外對SEB的功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)適體濃度達(dá)到200nmol/L時(shí)，PBMC的SI值降低至1.03，IFN—γ分泌量減少至25ng/ml，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示適體對SEB促PBMC增殖的超抗原活性具有一定的抑制作用。 結(jié)論:

8、 本研究運(yùn)用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，成功篩選到針對SEB的高親和力和高特異性的ssDNA適體群。利用篩選到的針對SEB特異性適體群，建立酶連接適體免疫混合夾心法和金標(biāo)雙適體夾心斑點(diǎn)滲濾法用于SEB定量、定性快速檢測；具有良好的靈敏度與特異性。通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞因子定量分析顯示適體在體外對SEB的超抗原活性具有明顯的抑制作用。利用SELEX技術(shù)篩選SEB特異性適體為感染金黃色葡萄球菌產(chǎn)生SEB的臨床快速鑒定和