SELEX技術(shù)篩選金黃色葡萄球菌毒性休克綜合征毒素-1適配體及其功能研究.pdf

1、目的:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的毒性休克綜合征毒素-1(Toxic Shock Syndrome Toxin-1，TSST-1)引發(fā)中毒性休克綜合征(Toxic ShockSyndrome，TSS)，通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞使其活化、增殖，引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。目前針對(duì)TSST-1本身的治療手段不多，合成寡核苷酸文庫(kù)和親和力篩選作為獲得高親和力、高特異性適配體(Aptamer)的一種方便、快捷、有效的方法

2、。本研究利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)篩選具有高親和力并特異性識(shí)別TSST-1的DNA適配體，并評(píng)估適配體對(duì)TSST-1功能的抑制作用，為探索金黃色葡萄球菌TSST-1誘導(dǎo)TSS新的治療方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:我們選取TSST-1作為靶標(biāo)，體外合成中間含有25個(gè)隨機(jī)序列全長(zhǎng)為63個(gè)堿基的單鏈DNA(

3、ssDNA)文庫(kù)。利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，以羧基磁珠作為固相介質(zhì)，從ssDNA文庫(kù)中篩選TSST-1適配體，利用生物信息學(xué)方法對(duì)適配體進(jìn)行序列同源性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證適配體結(jié)合性質(zhì)，運(yùn)用熒光定量法分析候選適配體的親和力及特異性，CCK-8法檢測(cè)候選適配體對(duì)TSST-1刺激PBMCs增殖抑制反應(yīng)。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)8輪的反復(fù)篩選，監(jiān)測(cè)ssDNA文庫(kù)的親和力不斷升高，獲得了特異性識(shí)別TSST-1的DNA適配

4、體T-7，其全長(zhǎng)為63nt。它可選擇性的與TSST-1結(jié)合，而與BSA，裸磁珠的交叉結(jié)合力較弱，并測(cè)定其與TSST-1的解離常數(shù)為103.8nM。當(dāng)適配體為10μM時(shí)，可有效抑制TSST-1介導(dǎo)的PBMCs增殖作用(P＜0.05)，其抑制率達(dá)63.6％。
　　結(jié)論:本研究利用bead-SELEX技術(shù)篩選出新型適配體T-7，它能選擇性識(shí)別TSST-1。在體外實(shí)驗(yàn)中，該適配體能使TSST-1刺激PBMCs的增殖水平明顯降低(P＜0.0