金黃色葡萄球菌腸毒素B引起THP-1細胞凋亡的作用與機制研究.pdf

1、細胞凋亡(Apoptosis)是多細胞生物中重要的生物學過程，具有影響組織分化、新陳代謝及免疫調(diào)節(jié)等多方面功能。在細菌引起的感染性疾病中，細菌的特定組分可以通過多種途徑調(diào)控宿主細胞的凋亡，而這也被證實對疾病的進程有著至關(guān)重要的影響。
　　金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為重要的人類病原菌，在其感染過程中也可引起宿主細胞凋亡。在許多與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的疾病，如特應性皮炎(Atopic Dermat

2、itis，AD)和膿毒癥(sepsis)中，異常的宿主細胞凋亡現(xiàn)象可顯著影響疾病的進程、嚴重程度和預后。金黃色葡萄球菌的一個重要特點是其可分泌多種毒素，包括溶血素、殺白細胞素、腸毒素及分泌酶等。其中腸毒素是一種重要的金黃色葡萄球菌超抗原，在很多與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)的疾病中發(fā)揮著重要的作用。腸毒素的天然受體包括T細胞受體(TCR)和主要組織相容性復合體Ⅱ類分子(major histocompatibility complexⅡ，MHC

3、Ⅱ)，金葡菌腸毒素結(jié)合TCR可持續(xù)激活T細胞引起超敏反應;而結(jié)合MHICⅡ則具有促細胞凋亡作用。在腸毒素家族中，金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）分布較廣、研究也較為深入。SEB已被證實能夠引起T細胞和外周血單核細胞(PBMC)凋亡，且這種細胞凋亡與金黃色葡萄球菌引起的疾病，如AD等密切相關(guān)。但SEB是否能引起單核-巨噬細胞凋亡，以及其分子機制目前仍不清楚。
　　本研究從我室

4、分離并完成全基因組測序的金黃色葡萄球菌XQ株基因組中克隆、表達并純化了具有生物學活性的重組SEB蛋白，開展了SEB引起THP-1單核-巨噬細胞凋亡的作用及其機制研究，發(fā)現(xiàn)了一個依賴于TNFα的正反饋回路在此過程中起到非常重要的作用;同時發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白2A(metallothionein2A，MT2A)可通過促進SEB引起的TNFα表達上調(diào)，從而促進TNFα正反饋回路的形成，在SEB引起THP-1細胞凋亡的過程中具有重要地位。所得研究結(jié)果

5、為將來深入闡明金黃色葡萄球菌腸毒素的作用機制以及宿主細胞應對毒素攻擊的機制提供了重要參考。本論文的主要研究方法和結(jié)果如下：
　　1.重組SEB蛋白的表達載體構(gòu)建、表達與純化
　　以金黃色葡萄球菌XQ株全基因組為模板，利用PCR技術(shù)獲得SEB編碼序列，再通過BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切以及采用T4連接酶與表達載體連接，成功構(gòu)建了表達質(zhì)粒pET30a-SEB。將表達質(zhì)粒pET30a-SEB轉(zhuǎn)化入表達菌株大腸埃希菌C43后，成功誘導

6、表達出重組SEB蛋白。
　　表達的重組SEB蛋白經(jīng)過鎳柱親和層析純化后，利用去內(nèi)毒素凝膠柱去除內(nèi)毒素、超濾柱濃縮并置換緩沖液為PBS緩沖液，最終以SDS-PAGE測定重組蛋白純度、Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度及鱟試劑反應實驗檢測殘留內(nèi)毒素，結(jié)果重組SEB蛋白的純度在95％以上，濃度為539.2μg/ml，毒素含量低于2EU/ml，滿足后續(xù)細胞實驗要求。
　　2.重組SEB蛋白具有引起THP-1細胞凋亡的作用
　　委

7、托北京閱微基因技術(shù)有限公司對獲贈的THP-1細胞系進行STR檢測，細胞中沒有發(fā)現(xiàn)人類細胞交叉污染，與美國模式培養(yǎng)物保存中心(American type culturecollection，ATCC)中THP-1細胞的STR數(shù)據(jù)匹配率為93.33％，證實我們的細胞系為THP-1的衍生細胞系。
　　利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細胞分析，確定了重組SEB蛋白具有引起THP-1細胞凋亡作用，細胞凋亡比例約為3％，并且具有時間和劑

8、量依賴效應。利用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK，證實重組SEB蛋白引起的THP-1細胞凋亡依賴caspase的級聯(lián)激活。
　　在IFN-γ激活及PMA誘導分化后的THP-1細胞中，利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細胞分析，檢測到重組SEB蛋白引起的細胞凋亡比例更高，分別約為7.5％和15％。內(nèi)毒素激活THP-1細胞后并不增強重組SEB蛋白引起THP-1細胞凋亡的作用。然而IFN-γ激活和PMA誘導分化后，陰性對照

9、組中THP-1細胞凋亡也有所上升。為避免額外因素的干擾，在接下來的研究中均直接使用重組SEB蛋白作用于THP-1細胞而不再進行額外的細胞激活或誘導分化。
　　3.重組SEB蛋白引起THP-1細胞凋亡依賴于一個TNFα的正反饋回路
　　經(jīng)典的細胞凋亡包括外源性（caspase8激活）和內(nèi)源性（caspase9激活）兩條途徑，通過caspase-3，-8，-9活性檢測試劑盒對重組SEB蛋白作用后的TPH-1細胞之相應酶活性檢測發(fā)

10、現(xiàn)，重組SEB蛋白引起的THP-1細胞凋亡依賴caspase-3和-8的激活而不依賴caspase-9的激活，說明外源性通路在SEB引起THP-1細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
　　利用RT-qPCR檢測重組SEB蛋白處理后THP-1細胞中凋亡相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組SEB蛋白處理后，THP-1細胞中TNFα和HLA-DRa的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。進一步利用ELISA和Western blot實驗，證實了重組SEB蛋白在THP-

11、1細胞中引起的TNFα和HLA-DRa表達升高。
　　利用anti-TNFα單克隆抗體中和TNFα作用后，檢測到重組SEB蛋白引起的THP-1細胞凋亡比例下降至約1％，與重組SEB蛋白直接作用后的3.5％存在顯著差異，而同型對照抗體則無此作用，證實TNFα在SEB引起的THP-1細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　利用siRNA干擾HLA-DRa和TNFR1的表達，發(fā)現(xiàn)在干擾后的THP-1細胞中，重組SEB蛋白引起的凋亡細胞比

12、例（約2.5％）顯著低于用無目標siRNA干擾的對照組細胞（約9％）。同時，HLA-DRa和TNFR1siRNA干擾的THP-1細胞在重組SEB蛋白作用后，TNFα分泌水平也顯著低于無目標siRNA干擾的對照組細胞。而TNFα本身又會上調(diào)HLA-DRa的表達，從而增加了重組SEB蛋白與HLA-DRa的結(jié)合，使得TNFα的分泌進一步增加，于是形成了一個依賴于TNFα的正反饋回路。重組SEB蛋白引起的THP-1細胞凋亡依賴于這一正反饋回路的

13、形成和完整。
　　4.MT2A通過促進TNFα的正反饋回路從而促進重組SEB蛋白引起的THP-1細胞凋亡
　　作為SEB的受體，THP-1細胞的HLA-DRa僅有的胞質(zhì)區(qū)僅含15個氨基酸殘基，且不含任何已知的結(jié)構(gòu)域，HLA-DRa與SEB結(jié)合后，后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導很可能依靠與HLA-DRa直接結(jié)合的其他膜蛋白來實現(xiàn)。且SEB結(jié)合HLA-DRa以后如何上調(diào)TNFα的表達機制也不清楚。利用免疫共沉淀技術(shù)，通過anti-HLA-DRa

14、單克隆抗體去捕捉與HLA-DRa相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了一個金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)MT2A可能參與了SEB引起的THP-1細胞凋亡作用過程。
　　利用RT-qPCR分析了THP-1細胞中MTs的表達譜及其在重組SEB蛋白作用后轉(zhuǎn)錄水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)THP-1細胞中表達的MTs包括MT1E、F、G、X和MT2A，在重組SEB蛋白作用后，僅MT2A表達上升。Western blot實驗進一步證實了重組

15、SEB蛋白作用后THP-1細胞中MT2A的表達上升約50％。利用AnnexinⅤ+PI雙染色及流式細胞分析，發(fā)現(xiàn)在siRNA干擾MT2A表達的THP-1細胞中，重組SEB蛋白作用后的細胞凋亡比例（約4％）明顯少于無目標siRNA干擾的對照組細胞（約8％）。利用ELISA和Western blot實驗，進一步檢測到在siRNA干擾MT2A表達的THP-1細胞中，重組SEB蛋白作用后TNFα和HLA-DRa表達水平均降低，說明MT2A通過促