微孔板式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin,SE)是金黃色葡萄球菌分泌的細菌外毒素。SE主要分為SEA、SEB、SEC、SED、SEE五型，SEC可分為SEC1、SEC2和SEC3三種亞型。有學(xué)者將中毒性休克綜合征毒素(toxic shock syndrome toxin 1,TSST-1)稱為SEF。SE各型的分子量相近，約為26～30kDa，在高溫條件下和經(jīng)過蛋白水解酶的作用后，SE仍可保持生物學(xué)活性

2、。各型SE在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。隨著新的檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，一些新型SE或與SE引起的食物中毒有密切相關(guān)的毒素相繼被發(fā)現(xiàn)。腸毒素是根據(jù)其引起嘔吐的性質(zhì)來命名的，已經(jīng)確定與嘔吐反應(yīng)有關(guān)的新型腸毒素分別是SEG、SEH和SEI，另有與SE食物中毒有密切相關(guān)的毒素(SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SEU和SEV)，其致吐作用尚未確定，這些相關(guān)毒素被命名為“staphylococcal entero

3、toxin-like(SEl)SAgs”，即“金黃色葡萄球菌腸毒素樣超抗原”，上述相關(guān)毒素可稱為SElJ-SElV。
　　SE最突出的特點是具有超抗原活性。超抗原(Superantigen,SAg)指具有絲裂原作用，僅需要極低濃度（1～10ng/ml）就可以激活2％～20％T細胞克隆，使淋巴細胞增殖，產(chǎn)生極強的免疫應(yīng)答的一類抗原。SAg可分為T細胞超抗原和B細胞超抗原。T細胞超抗原可根據(jù)其作用的T細胞受體類型分為TCRγδ型超抗原

4、和TCRαβ型超抗原，SE屬于TCRαβ型超抗原。SE對免疫系統(tǒng)有免疫激活作用，其分子的一端與抗原提呈細胞上MHCII類分子抗原結(jié)合溝槽α螺旋的外側(cè)結(jié)合，另一端同T細胞表面TCR的某些Vβ基因編碼片段結(jié)合，形成MHCII類分子-SE-TCRVβ三重復(fù)合物。MHCII類分子和SE組成的復(fù)合體與TCR結(jié)合不緊密，SE激活一個T細胞后解離可激活其它的T細胞，這樣就使得少量SE能夠激活多克隆的T細胞。T細胞被激活后，產(chǎn)生多種細胞因子，如IFN-

5、γ、IL-2、CSF和TNF-α等，參與某些病理過程的發(fā)生和發(fā)展。
　　不同金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的SE種類差別較大，同一菌株可產(chǎn)生多種SE。另一方面，不同腸毒素基因序列間相似性較高，部分毒素基因存在密切的連鎖關(guān)系。為充分認識和理解各型腸毒素的致病機理，需要對不同菌株中各型毒素的分布、各毒素基因型間的關(guān)系、毒素蛋白的表達和性質(zhì)進行深入細致的研究。
　　SE引起的食物中毒在細菌性食物中毒中占有很高的比例。SEB的半數(shù)致死劑量(

6、LD50)約20ng/kg，半數(shù)有效劑量(ED50)約0.4ng/kg可以致殘。SEB性質(zhì)穩(wěn)定，而且易于制備，能夠以氣溶膠的形式散布。SEB被美國疾病控制中心確定為B類生物戰(zhàn)劑。因此，在食物、水源和人的體液中能檢測出低劑量SEB的高靈敏度和高特異性的方法對食品安全衛(wèi)生和反恐怖戰(zhàn)爭具有十分重要的意義。
　　隨著對SE研究的日益深入，檢測SE的方法也得到不斷的發(fā)展和提高，向著高特異性、高靈敏度、簡便、快速的方向發(fā)展。傳統(tǒng)的方法，如反向

7、被動乳膠凝集法(RPLA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)等，由于靈敏度較低，其應(yīng)用受到了很大的限制。Khreich等使用免疫熒光技術(shù)能夠在檢測緩沖液中檢測到的0.02ng/mL的SEB。近年來，建立在抗原抗體相互作用基礎(chǔ)上的生物傳感器技術(shù)在檢測SEB領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。如表面等離子共振生物傳感器(Surface plasmon resonancebiosensor

8、,SPR)、共振聲譜分析（Resonant acoustic profiling,RAP）、生物半導(dǎo)體技術(shù)(Biological semiconductors,BSCs)、流動注射電容生物傳感器(Flow-injection capacitive biosensor)等。生物傳感器檢測靈敏度高，如流動注射電容生物傳感器能檢測到最低劑量為0.3pg/ml的SEB，但生物傳感器價格昂貴，不適合進行高流通量檢測，目前主要應(yīng)用于科學(xué)研究。

9、>　　化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測法(Chemiluminescent immunoassay,CLEIA)因其具備靈敏度高、較寬的線性動力學(xué)范圍以及簡便快速等特點，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用，其靈敏度可以和放射免疫檢測相媲美。CLEIA的基本原理是化學(xué)發(fā)光的強度和反應(yīng)物或產(chǎn)物的濃度呈正比。CLEIA是建立在抗原抗體復(fù)合物基礎(chǔ)之上，因此具有極高的特異性和靈敏度。CLEIA中常使用的標記物有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)等。
　　抗體

10、和酶是影響CLEIA靈敏度的兩個關(guān)鍵因素。我們篩選出一對特異性強的抗體配對，使用辣根過氧化物酶標記抗體，利用魯米諾作為發(fā)光底物，建立了具有高度靈敏的微孔板式CLEIA檢測SEB的方法。微孔板式CLEIA與電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)和生物傳感器相比，具有操作簡便的特點，檢測速度快，約2分鐘就可以完成一塊96空板的檢測，能滿足需要高通量運行的臨床檢測的需要。
　　本研究中，我們使用常規(guī)方法制

11、備了20株針對SEB分子的單克隆抗體，并進行了腹水效價測定和抗體表位鑒定，從中篩選出兩株效價高、特異性強，識別不同表位組的兩株單抗組成抗體配對，并對CLEIA的反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。本方法的線性動力學(xué)范圍在0.01-5ng/mL之間，實際可測的檢測限(limit of detection,LOD)達到0.01ng/mL，批內(nèi)和批間變異均小于13％。本方法特異性強，與SEA、SEC1和SED之間不存在交叉反應(yīng)，可用于不同基質(zhì)中SEB的檢測，