金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種人獸共患病病原體，屬于革蘭陽(yáng)性球菌，廣泛存在于自然界，可以引起人和其他動(dòng)物的各種疾病。目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法有很多，但這些方法大都比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且價(jià)格昂貴。
　　 目的:建立一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌的簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。使用該方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否感染金黃色葡萄球菌，并且與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行比較，探討該方法的可行性。
　　 方法:1.根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶nuc基因，設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物及

2、兩條特異性探針，探針使用多聚物進(jìn)行加尾。用生物素標(biāo)記通用引物的5'端，使用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得用于雜交的日的片段。
　　 2.將兩條特異性探針固定于硝酸纖維膜上，使PCR產(chǎn)物與探針雜交。設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)探針的修飾及濃度、雜交條件、洗脫條件、抗體濃度等進(jìn)行優(yōu)化，篩選得到最佳反應(yīng)條件，用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。
　　 3.使用建立的反向線性雜交方法方法對(duì)重慶地區(qū)74只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，同時(shí)使用傳統(tǒng)方法對(duì)

3、這些樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的一致性。
　　 結(jié)果:1.選擇金黃色葡萄球菌的保守序列設(shè)計(jì)了引物及特異性探針，成功構(gòu)建了nuc基因的重組質(zhì)粒。2.優(yōu)化后的最佳雜交反應(yīng)條件為:探針進(jìn)行15C多聚加尾，探針濃度為50μmol/L，采用紫外交聯(lián)及高溫烘烤的方式固定探針。生物素-堿性磷酸酶抗體稀釋倍數(shù)為1∶5000。37℃雜交60min，并用洗脫液(0.5×SSC，0.1％ SDS)在50℃洗脫15 min，使用堿性磷酸酶催化NBT/B