納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗制備及免疫保護(hù)機(jī)制初步研究.pdf

1、目的:
　　本課題在綜合分析傳統(tǒng)免疫佐劑的優(yōu)缺點(diǎn)、借鑒現(xiàn)代免疫佐劑的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)和發(fā)展趨勢(shì)、在新型納米乳佐劑研究工作的基礎(chǔ)上，有機(jī)整合目前人用佐劑中的有效成分、合理優(yōu)化佐劑組分的制劑配比，設(shè)計(jì)并制備具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型納米乳佐劑，以金黃色葡萄球菌的全身感染模型為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在進(jìn)行其處方優(yōu)化、制劑工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從血清學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、動(dòng)物整體水平對(duì)其激發(fā)的免疫應(yīng)答譜學(xué)特征及作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，為新型有效的金黃色葡

2、萄球菌基因工程疫苗的設(shè)計(jì)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。
　　方法:
　　第一部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗制備與表征鑒定
　　(1)通過(guò)低能乳化法制備了三種載藥方式的納米乳佐劑疫苗，即包裹載藥疫苗，混合載藥疫苗，聯(lián)合載藥疫苗。
　　(2)通過(guò)高速離心法以及粒度分析儀，透射電子顯微鏡，高分辨率電子掃描顯微鏡等充分檢測(cè)并評(píng)價(jià)了納米乳佐劑疫苗的形態(tài)學(xué)特征。
　　第二部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗的免疫學(xué)評(píng)

3、價(jià)
　　(1)使用制備的三種載藥方式的納米乳佐劑疫苗與MF59佐劑疫苗，經(jīng)6-8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉注射途徑免疫，分別在第6天，第13天尾靜脈取血，收集血清，無(wú)菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。在小鼠末次免疫后?0天，實(shí)驗(yàn)組小鼠均摘眼球收集全血，收集血清，無(wú)菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)，取血后的小鼠經(jīng)手術(shù)分離脾臟并制備單細(xì)胞懸液，無(wú)菌分裝保存于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱備用。
　　(2)ELISA法檢測(cè)疫苗免疫后血清的特異性Ig

4、G、IgG1、IgG2a、IgG2b抗體應(yīng)答水平。
　　(3)通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分離脾細(xì)胞的增殖能力;ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分離脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ，IL-4的細(xì)胞量;ELISA法檢測(cè)分離脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HI抗原刺激后表達(dá)含量變化;流式檢測(cè)分離脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HI抗原刺激后CD4+T細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞含量。
　　(4)疫苗免疫后小鼠感染劑量攻毒后，對(duì)主要臟器的細(xì)菌定植量變化檢測(cè);疫苗免疫后小鼠感染劑量攻毒后，對(duì)腎臟切片并進(jìn)行

5、HE染色及病理分析;疫苗免疫后小鼠致死劑量攻毒后，對(duì)生存率以及疫苗保護(hù)率分析。
　　(5)本論文所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0分析，采用非配對(duì)T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有圖示使用GraphPad Prism6.0軟件制作。P值小于0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P值小于0.01代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異。
　　第三部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗免疫保護(hù)機(jī)制初步研究
　　培養(yǎng)小鼠原代骨髓來(lái)源DC細(xì)胞，激光共聚

6、焦技術(shù)檢測(cè)納米乳佐劑疫苗被DC細(xì)胞吞噬效率。通過(guò)活體成像技術(shù)檢測(cè)納米乳佐劑疫苗在皮下注射與肌肉注射兩種給藥方式下的緩釋作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗制備與表征鑒定結(jié)果
　　制備的納米乳佐劑疫苗是穩(wěn)定存在的納米乳球形顆粒，而且分散性良好。通過(guò)高分辨率掃描電子顯微鏡分析，更加直觀證明制備的納米乳佐劑疫苗形態(tài)學(xué)特征是粒度均一，分散性良好的球形顆粒。
　　第二部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌

7、疫苗的免疫學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果
　　(1)疫苗免疫小鼠后的血清學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果:
　　納米乳佐劑疫苗的包裹載藥方式是一種有高效免疫增強(qiáng)效果的疫苗制備形式。
　　(2)疫苗免疫后小鼠的細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果
　　納米乳佐劑疫苗能夠有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生記憶性細(xì)胞，在抗原二次刺激時(shí)，脾淋巴細(xì)胞能夠迅速的增殖分化。
　　包裹載藥疫苗組能夠高效的刺激脾淋巴細(xì)胞分泌與細(xì)胞免疫相關(guān)的IFN-γ以及與體液免疫相關(guān)的IL-4。
　　包裹載藥疫苗

8、組與MF59佐劑疫苗組能夠高效刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，達(dá)到增強(qiáng)疫苗細(xì)胞免疫的效果。
　　納米乳佐劑疫苗能夠有效的提高與IL-4正相關(guān)的體液免疫應(yīng)答水平，其中聯(lián)合載藥方式的疫苗組效果較好，MF59佐劑對(duì)增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答水平不明顯。
　　MF59佐劑疫苗組能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-10來(lái)刺激B細(xì)胞增殖并且抑制Th1細(xì)胞的生成，進(jìn)而促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，但是后期促進(jìn)的效果并不明顯。相反包裹載藥疫苗組能夠有效的提高I

9、L-10分泌的含量，并與時(shí)間成正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證明，包裹載藥方式的疫苗是一種能夠有效刺激產(chǎn)生體液免疫相關(guān)的疫苗形式。
　　包裹載藥疫苗能夠高效誘導(dǎo)細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-12，進(jìn)而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，與檢測(cè)的IFN-γ水平以及結(jié)論類似，進(jìn)一步說(shuō)明包裹載藥疫苗能夠誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞免疫相關(guān)免疫應(yīng)答。
　　包裹載藥方式疫苗組與MF59佐劑疫苗組均能夠有效刺激產(chǎn)生IL-17，來(lái)促進(jìn)機(jī)體中性粒細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化起到清除細(xì)菌的作用。
　　納

10、米乳佐劑疫苗組的包裹載藥方式更容易高效激發(fā)CD4+中心記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生，而MF59佐劑更易刺激機(jī)體產(chǎn)生CD4+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞。
　　(3)疫苗免疫后小鼠的系統(tǒng)性評(píng)價(jià)結(jié)果
　　1)通過(guò)與攻毒1天后的對(duì)應(yīng)組別相比較，發(fā)現(xiàn)在全身感染3天后，血液以及脾臟的細(xì)菌定植量明顯減少，細(xì)菌定植主要在腎臟，對(duì)比感染后1天與3天的結(jié)果，包裹載藥疫苗組能夠有效的提高機(jī)體產(chǎn)生細(xì)菌清除效果，從整體器官的水平驗(yàn)證了該種載藥方式納米乳佐劑疫苗是一種有開(kāi)

11、發(fā)潛力的疫苗來(lái)抵御金黃色葡萄球菌的感染。
　　2)通過(guò)對(duì)腎臟切片病理?yè)p傷的綜合評(píng)價(jià)，包裹載藥疫苗組能夠產(chǎn)生最輕的病理?yè)p傷效果，且與未免疫后攻毒的對(duì)照組小鼠相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異(P＜0.001)。由此提示:腎臟切片病理評(píng)分結(jié)果與細(xì)菌定植量檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，再次驗(yàn)證包裹載藥疫苗組有望成為金黃色葡萄球菌疫苗的潛在候選疫苗。
　　3)3種不同載藥方式的納米乳佐劑疫苗以及MF59佐劑疫苗均能夠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用，其中包裹載藥方

12、式與聯(lián)合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組小鼠生存率為90％，混合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組小鼠生存率為80％，MF59佐劑疫苗組小鼠生存率為60％，HI疫苗組小鼠生存率為40％，His對(duì)照組小鼠生存率為20％。其中包裹載藥方式與聯(lián)合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組的生存率較His對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異(P＜0.01);包裹載藥方式與聯(lián)合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組的疫苗保護(hù)率為87.50％，混合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組的疫苗保護(hù)率為75.00％，

13、MF59佐劑疫苗組的疫苗保護(hù)率為50.00％，HI疫苗組的疫苗保護(hù)率為25.00％。由此提示，納米乳佐劑尤其是包裹載藥方式更能提高動(dòng)物生存率與疫苗保護(hù)率。
　　第三部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗免疫保護(hù)機(jī)制初步研究
　　(1)包裹載藥疫苗組免疫后小鼠淋巴節(jié)DC細(xì)胞表面中MHCⅠ分子的表達(dá)最為顯著，較HI疫苗組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，聯(lián)合載藥方式疫苗組次之;其中包裹載藥疫苗組免疫后小鼠淋巴節(jié)DC細(xì)胞表面中MH

14、CⅡ分子的表達(dá)量與HI疫苗組對(duì)比，存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，混合載藥方式疫苗組次之;其中混合載藥方式的納米乳佐劑疫苗免疫后小鼠淋巴節(jié)DC細(xì)胞表面中MHCⅡ分子的表達(dá)量與HI疫苗組對(duì)比，存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，包裹載藥方式疫苗組次之。得到推論，包裹載藥疫苗組能夠起到良好的免疫保護(hù)效果，其一個(gè)重要原因?yàn)楦妆籇C細(xì)胞捕獲，呈遞，進(jìn)而引發(fā)一系列的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
　　(2)激光共聚焦結(jié)果顯示包裹載藥疫苗組較混

15、合載藥方式的納米乳佐劑疫苗以及HI佐劑疫苗均有更加明顯的被DC細(xì)胞捕獲的效果。從而進(jìn)一步驗(yàn)證了推論，即包裹載藥疫苗組存在“蛋白貯庫(kù)”的作用，從而使更多抗原蛋白更易被DC細(xì)胞捕獲，呈遞，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　(3)活體成像結(jié)果結(jié)果表明，包裹載藥方式疫苗組在注射部位緩釋的效果更好，因此能夠不斷的釋放抗原被捕獲，引起高效的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論:
　　1.包裹載藥納米乳佐劑疫苗、混合載藥納米乳佐劑疫苗、聯(lián)