金黃色葡萄球菌流行病學(xué)及致病機制研究.pdf

1、目的：
　　本課題收集湖北省11家醫(yī)院和中南地區(qū)（湖北省，湖南省和河南省）6家醫(yī)院共768株金黃色葡萄球菌，分析其耐藥性及分子流行病學(xué)特征，以便為臨床抗感染治療提供依據(jù)；采用PAP/AUC、MET和MHA5T三種方法檢測hVISA，旨在尋找出一種可用于臨床檢測hVISA經(jīng)濟、準(zhǔn)確且簡便易行的方法；建立小鼠敗血癥模型，檢測小鼠體重、生存率、炎癥反應(yīng)、血液及組織細(xì)菌載量、組織病理學(xué)等變化，觀察mgrA基因?qū)π∈髷⊙Y進(jìn)程的影響，探討金

2、黃色葡萄球菌敗血癥的致病機制，為金黃色葡萄球菌敗血癥臨床診治提供新思路。
　　方法：
　　一.金黃色葡萄球菌毒力基因檢測及流行病學(xué)研究
　　1.收集湖北省11家醫(yī)院2010年5月1日至2010年12月31日分離的416株金黃色葡萄球菌及中南地區(qū)6家醫(yī)院2011年6月1日至2012年5月31日分離的352株金黃色葡萄球菌并通過革蘭染色、觸酶試驗、血漿凝固酶試驗和PCR的方法重新鑒定，瓊脂稀釋法檢測其對常用抗菌藥物的最小抑

3、菌濃度(MIC)。
　　2.采用多重PCR方法對MRSA菌株進(jìn)行SCCmec、MLST、spa和agr分型，陽性標(biāo)本進(jìn)行測序并擴增分離自中南地區(qū)6家醫(yī)院無菌體液標(biāo)本中的金黃色葡萄球菌31個毒力基因。
　　3.使用WHONET5.6軟件分析藥敏結(jié)果，其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS18.0軟件,以卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗比較組間差異（P<0.05，表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。
　　二、異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌檢測

4、方法及流行情況研究
　　1.使用PAP/AUC、MET和MHA5T三種方法檢測hVISA，并以PAP/AUC法作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較MHA5T和MET法檢測hVISA的敏感性及特異性。
　　2.數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，組間比較采用卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗(P<0.05，表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。
　　三、mgrA基因表達(dá)對金黃色葡萄球菌敗血癥進(jìn)程的影響
　　1.重疊延伸PCR+同源重組的方法敲除

5、金黃色葡萄球菌Newman株mgrA基因。
　　2.建立BALB/c小鼠敗血癥模型，實驗分為兩組，尾靜脈分別注射野生型Newman株和mgrA基因敲除株，即Newman組和mgrA knockout組，分析mgrA基因?qū)π∈髷⊙Y進(jìn)程的影響。
　　3.所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，生存曲線分析使用Kaplan-Meier法，小鼠體重改變采用Manne-Whitney U-test法，細(xì)胞因子水平、血液和組織細(xì)菌

6、載量結(jié)果用Student's t-test進(jìn)行分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　一.金黃色葡萄球菌毒力基因檢測及流行病學(xué)研究
　　1.湖北省11家醫(yī)院416株金黃色葡萄球菌共檢出209株MRSA，MRSA檢出率為50.2％。SCCmec分型分別為Ⅲ型，占82.8％（173/209）；Ⅳ型占13.4％（28/209）、Ⅱ型2.4％（5/209）和Ⅴ型，占1.4％（3/209）。
　　2.中南地區(qū)6

7、家醫(yī)院352株金黃色葡萄球菌共檢出118株MRSA，檢出率為33.5％。SCCmec分型主要為Ⅲ型，占80.5％（95/118），SCCmecⅣ型和Ⅱ型分別占8.5％（10/118）和5.1％（6/118）。agr分型分別為Ⅰ型，占81.4％（96/118），Ⅱ型，占15.3％（18/118），Ⅲ型，占1.7％（2/118），Ⅳ型占1.7％（2/118）。
　　3.中南地區(qū)6家醫(yī)院分離自無菌體液標(biāo)本的184株金黃色葡萄球菌中MRS

8、A流行率為41.8％（77/184）。MRSA和MSSA主要的流行克隆分別為ST239-SCCmecⅢ-t030-agr-Ⅰ(43/77，占55.8％)和ST188-MSSA-t189-agr-Ⅰ(22/107，占20.6％)。
　　4. MSSA菌株中pvl,tst，hlb,hlg-v,seb,sed和sei的流行率明顯高于MRSA菌株（P<0.05)，98株MSSA（53.3％）同時攜帶≥10個毒力基因，明顯高于MRSA菌株(

9、33.8％,26/77)(P=0.004)，24株non-hVISA（40.0％）同時攜帶≥10個毒力基因，明顯高于hVISA菌株(11.8％,2/17)(P=0.041)。與其它CCs克隆相比，CC1和CC398克隆表皮剝脫素基因檢出率更高（P<0.05),CC1和CC59克隆中pvl基因檢出率更高（P<0.05)。
　　二、異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌檢測方法及流行情況研究
　　1.與PAP/AUC法相比，MET法的

10、敏感性和特異性分別為81.6％和92.4％，MHA5T法的敏感性和特異性分別為92.1％和62.6％。
　　2.327株MRSA中共檢出hVISA58株，hVISA流行率為17.7％。其中湖北省11家醫(yī)院209株MRSA中有共檢出hVISA38株，流行率為18.2％；中南地區(qū)6家醫(yī)院118株MRSA中共檢出hVISA20株，流行率為16.9％。
　　3.58株hVISA的主要流行克隆為ST239-SCCmecIII-t030

11、-agrI型，占84.5％（49/58）。耐藥性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)hVISA對妥布霉素和左氧氟沙星的耐藥率明顯高于VSSA(P<0.05)。
　　三、mgrA基因表達(dá)對金黃色葡萄球菌敗血癥進(jìn)程的影響
　　1.兩組小鼠生存率和體重：Newman組有7只小鼠死亡（病死率70％），而mgrA knockout組僅有1只小鼠死亡（病死率10％），兩組間病死率具有明顯差異(log rank=4.739, P=0.029)。在兩組小鼠分別注射3×

12、106CFU劑量的細(xì)菌時監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，Newman組小鼠比mgrA knockout組體重下降更明顯（(P<0.05)。
　　2.兩組小鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值和血清TNF-a, IL-6水平：CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值在感染細(xì)菌24h達(dá)到高峰，在24h(P=0.0011)、8h(P=0.0025)和72h(P=0.0243)時，mgrA knockout組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值明顯低于Newman組。敗血癥誘導(dǎo)

13、后12h血清IL-6水平達(dá)到峰值，之后迅速下降，4h(P<0.0001)、12h(P<0.0001)、24h(P<0.0001)、48h(P=0.0003)和72h(P=0.0012)時，Newman組的血清IL-6水平顯著高于mgrA knockout組。血清TNF-a水平在敗血癥誘導(dǎo)后4 h升至最高，Newman組明顯高于mgrA knockout組(P=0.0032)。
　　3.兩組小鼠血液和組織細(xì)菌載量：Newman組小鼠

14、腎臟和肝臟組織的細(xì)菌載量明顯高于mgrA knockout組(Log10CFU/g腎臟:7.53+0.23 vs6.02+0.33,P<0.001;Log10CFU/g肝臟:5.82+0.26 vs4.84+0.29,P=0.024)。兩組小鼠脾臟細(xì)菌載量沒有明顯差異(Log10 CFU/g脾臟:4.67+0.19 vs4.51+0.54, P=0.404)。
　　4.組織病理學(xué)改變：在注射細(xì)菌后1d Newman組小鼠出現(xiàn)輕微的

15、組織病理學(xué)改變，而mgrA knockout組沒有發(fā)現(xiàn)明顯改變。2d和4d時，兩組小鼠肝臟和腎臟出現(xiàn)輕至中度病理學(xué)改變，脾臟出現(xiàn)輕微的病理學(xué)改變，脾臟體積明顯增大。Newman組病理學(xué)改變明顯比mgrA knockout組嚴(yán)重，7d時，兩組小鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的病理學(xué)變化。
　　結(jié)論：
　　1.中南地區(qū)分離自無菌體液標(biāo)本中的MRSA菌株，主要流行克隆為ST239-MRSA-SCCmecⅢ-t030-agrⅠ型，占55.8％，表明本

16、地區(qū)存在耐藥株的傳播，醫(yī)療部門應(yīng)采取有效的措施控制耐藥克隆的傳播,如加強手部衛(wèi)生、隔離患者、嚴(yán)格注意無菌操作、加強醫(yī)院環(huán)境衛(wèi)生等。
　　2.湖北省11家醫(yī)院及中南地區(qū)6家醫(yī)院768株金黃色葡萄球菌中hVISA流行率達(dá)17.7％。因hVISA主要由糖肽類藥物選擇性壓力產(chǎn)生，故臨床應(yīng)重視合理使用抗生素。
　　3.PAP/AUC法是目前檢測hVISA最準(zhǔn)確的方法，但由于操作較為繁瑣，難以應(yīng)用于臨床，MHA5T法檢測hVISA的敏感

17、性高達(dá)92.1％，推薦其可用于臨床hVISA的初篩，初篩陽性的標(biāo)本可再使用PAP/AUC法進(jìn)行確證，以減少工作量和E-test實驗條的使用。
　　4.mgrA基因在金黃色葡萄球菌敗血癥進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，在小鼠敗血癥模型中，mgrA可增加小鼠的死亡率，加劇敗血癥的發(fā)生和發(fā)展，與mgrA knockout組相比，Newman組小鼠具有更激烈的炎癥反應(yīng)，更多的血液和組織細(xì)菌載量和更嚴(yán)重的組織病理學(xué)變化，mgrA基因表達(dá)有助于金黃色葡萄