金黃色葡萄球菌RAP與TRAP蛋白的基因表達及免疫保護作用.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Saureus)是一種重要的致病菌，可以引起人和動物的多種疾病，其主要致病物質是毒素和酶。在S.aureus對數(shù)生長的中后期，細菌開始分泌RAP，RAP通過作用于膜表面的TRAP調(diào)控S.aureus各種毒素和酶的表達，進而對動物產(chǎn)生致病作用。但目前將RAP和TRAP免疫動物能否產(chǎn)生良好免疫保護作用仍不十分清楚。因此，本實驗用原核表達的RAP和TRAP分別免疫小鼠，研究它們的免疫保護作用。 本課題采用PCR方法擴增

2、金黃色葡萄球菌毒力調(diào)控蛋白RAP基因和TRAP基因，將這兩條基因片段純化回收，分別與pMD18-T載體連接，并轉化XLl-Blue大腸桿菌。經(jīng)PCR.和BamHI、Sall雙酶切鑒定后，將所獲得的陽性克隆質粒命名為pMD-rap和pMD-trap。實驗進一步將兩個陽性克隆和pQE-30空載體用BamHI、SalI雙酶切后回收，將從pMD-rap和pMD-trap上酶切獲得的rap和trap片段分別與雙酶切后的pQE-30載體連接，構建出

3、重組表達載體pQE-rap和pQE-trap，并分別轉化XLl-Blue大腸桿菌。分別將pQE-rap和pQE-trap進行測序，測序結果與Genbank中公布的序列相比，rap的同源性在99％以上，而trap的同源性為100％，編碼的氨基酸序列的同源性為99.8％和100％。含有pQE-rap和pQE-trap的重組菌XLl-Blue經(jīng)IPTG誘導后進行SDS-PAGE電泳，并用抗Histidine單抗進行Western Blot分析

4、，結果證明重組菌表達出分子量約39kDa和22kDa的蛋白質，二者分子量大小與DNAStar分析結果也相符，表明目的蛋白基因成功獲得表達。在此基礎上，用MagneHis<'TM>蛋白純化系統(tǒng)對表達的RAP和TRAP蛋白進行純化，用弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，每種蛋白分為10μg、20μg和50μg三個劑量，同時設生理鹽水對照組。首次免疫后四周進行二次免疫，再過一周對小鼠進行攻毒，并觀察13天。結果與對照組相比，至第13天，RAP和TRAP最