金黃色葡萄球菌sarA基因缺失突變株的構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　利用同源重組技術(shù)構(gòu)建金黃色葡萄球菌sarA基因缺失突變株，進(jìn)一步深入研究sarA基因在毒力因子表達(dá)中的調(diào)控功能。
　　方法：
　　選取sarA基因陽性，藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)紅霉素和壯觀霉素敏感的金黃色葡萄球菌臨床分離株;采用溫度敏感性質(zhì)粒pMAD敲除金黃色葡萄球菌75臨床分離株sarA基因。用PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌75臨床分離株的sarA基因同源上下游保守片斷，經(jīng)回收、酶切、連接等過程后轉(zhuǎn)入pMAD-spc質(zhì)粒

2、，構(gòu)建含有壯觀霉素抗性基因（spc）和sarA基因上、下游同源DNA片段的pMAD-△sarA質(zhì)粒，將pMAD-△sarA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220中，再把pMAD-△sarA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌75臨床分離株中，把含重組質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌75臨床分離株在42℃條件下振搖培養(yǎng)，篩選金黃色葡萄球菌75臨床分離株的sarA基因缺失可疑突變株;根據(jù)藍(lán)白斑原則進(jìn)行sarA基因缺失突變株的篩選，對(duì)篩選到的可疑突變株進(jìn)行基因組水平和

3、轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證。通過穿梭質(zhì)粒pCN51構(gòu)建金黃色葡萄球菌sarA突變株的回復(fù)株。
　　結(jié)果：
　　選取分離自皮膚軟組織化膿性感染患者膿液標(biāo)本的金黃色葡萄球菌臨床分離株75，經(jīng)革蘭染色、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)及全自動(dòng)微生物分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌，經(jīng)PCR證實(shí)sarA基因陽性，藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)紅霉素和壯觀霉素敏感;將壯觀霉素抗性基因(spc，1300bp)、sarA基因上游片斷的PCR產(chǎn)物(820bp)、sarA基因下游片斷的PCR產(chǎn)

4、物(1140bp)三者分別連接入pMAD載體，以得到同源重組質(zhì)粒pMAD-△sarA(12926bp)。pMAD-△sarA質(zhì)粒先后被電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220和金黃色葡萄球菌75臨床分離株后，通過提高已轉(zhuǎn)入pMAD-△sarA的金黃色葡萄球菌SA75株菌液的培養(yǎng)溫度(42℃)使質(zhì)粒復(fù)制受損，同時(shí)維持50μg/ml濃度的壯觀霉素促進(jìn)同源重組的發(fā)生，總共經(jīng)過2次傳代培養(yǎng)后，獲得1個(gè)菌落呈現(xiàn)白色且壯觀霉素抗性、紅霉素敏感的疑似突變株。

5、以初篩獲得的疑似突變株基因組作為模板，以上游同源臂外側(cè)的正義引物和spc基因片段的反義引物、下游同源臂外側(cè)的反義引物spc片段的正義引物、上游同源臂外側(cè)的正義引物下游同源臂外側(cè)的反義引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了一大小為2270bp、2550bp和3520bp的片段。以突變株cDNA作為模板PCR擴(kuò)增sarA基因，結(jié)果未能得到特異性的產(chǎn)物。經(jīng)過驗(yàn)證，金黃色葡萄球菌75臨床分離株sarA基因缺失突變株構(gòu)建成功。通過穿梭質(zhì)粒pCN51成功構(gòu)