金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：建立防耐藥變異濃度(MutantPreventionConcentration，MPC)體外測(cè)定方法，并測(cè)定氟喹諾酮類(FQ)藥物莫西沙星、加替沙星、帕珠沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC25923同源耐藥突變株及臨床分離金黃色葡萄球菌的MPC和耐藥突變選擇窗(MutantSelectionWindow，MSW)，結(jié)合已有的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)不同F(xiàn)Q藥物的MSW大小及抑制耐藥突變株選擇的能力。

2、同時(shí)觀察FQ藥物濃度對(duì)耐藥突變株恢復(fù)生長(zhǎng)和耐藥突變位點(diǎn)選擇的影響。在以上體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以左氧氟沙星-金黃色葡萄球菌ATCC25923為例，從動(dòng)物體內(nèi)水平初步驗(yàn)證MSW理論，找出能夠預(yù)測(cè)耐藥突變株在體內(nèi)選擇性富集的藥代、藥效動(dòng)力學(xué)(PK/PD)參數(shù)。進(jìn)一步通過(guò)分離結(jié)核患者前鼻腔攜帶的利福平敏感的金黃色葡萄球菌在應(yīng)用含利福平的聯(lián)合化療方案治療后轉(zhuǎn)為對(duì)利福平耐藥的菌株，從臨床水平初步驗(yàn)證MSW理論。 方法：(1)肉湯法富集1010

3、cfu/ml金黃色葡萄球菌，采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定FQ藥物對(duì)金黃色葡萄球菌不同菌株的MIC、MIC99、MPC和耐藥突變菌恢復(fù)生長(zhǎng)菌落數(shù)，并通過(guò)對(duì)grlA和gyrA的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，明確不同F(xiàn)Q藥物濃度對(duì)耐藥突變位點(diǎn)的影響。(2)建立兔組織籠金黃色葡萄球菌ATCC25923感染模型，通過(guò)灌胃方法分別給予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg和40mg/kg左氧氟沙星治

4、療，使組織籠內(nèi)藥物濃度分別低于MIC99、位于MIC99和MPC之間(MSW內(nèi))、高于MPC及在治療過(guò)程中藥物濃度有不同時(shí)間跨MSW，對(duì)照組應(yīng)用生理鹽水灌胃。觀察組織籠內(nèi)細(xì)菌耐藥突變株的選擇和MIC變化情況，并采用液相色譜法測(cè)定組織液內(nèi)左氧氟沙星濃度。分析組織籠內(nèi)左氧氟沙星濃度與出現(xiàn)耐藥的關(guān)系。(3)篩選鼻腔攜帶金黃色葡萄球菌的結(jié)核病患者，觀察含利福平的聯(lián)合化療方案治療前后金黃色葡萄球菌對(duì)利福平的藥敏變化，分離由治療前利福平敏感轉(zhuǎn)為治療

5、后耐藥的金黃色葡萄球菌菌株。通過(guò)spa和PFGE分型，確定治療前后分離菌株同源性。(4)通過(guò)紙片法測(cè)定前鼻腔分離的所有金黃色葡萄球菌的藥敏特性。 結(jié)果：第一部分：(1)莫西沙星、加替沙星、帕珠沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923的MPC分別為0.18、0.3、0.75、0.8和1.8μg/ml，選擇指數(shù)(SI)分別為9.0、7.5、8.0、8.3和10.6。(2)FQ藥物濃度對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥突變株恢復(fù)

6、生長(zhǎng)菌落數(shù)和耐藥位點(diǎn)的選擇有明顯的影響。(3)對(duì)于金黃色葡萄球菌ATCC25923的同源耐藥突變株，加替沙星和莫西沙星對(duì)第一步耐藥突變株的MPC明顯低于環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和帕珠沙星。第一步耐藥突變株的MSW較ATCC25923的MSW明顯增寬，以帕珠沙星最為明顯。第二步耐藥突變株對(duì)加替沙星和莫西沙星仍然敏感，但MPC高達(dá)8～16μg/ml。(4)莫西沙星、加替沙星、帕珠沙星和環(huán)丙沙星對(duì)42株環(huán)丙沙星敏感的金黃色葡萄球菌臨床分離菌的MP

7、C90值分別為0.5μg/ml、0.5μg/ml、4μg/ml和8μg/ml。SI分別為4、4、16和16。莫西沙星和加替沙星對(duì)12株環(huán)丙沙星耐藥的金黃色葡萄球菌臨床分離菌的MPC90均為16μg/ml，而MPC90/MIC90比值均為8。 第二部分：(1)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)左氧氟沙星組織液濃度位于MSW內(nèi)時(shí)，容易導(dǎo)致ATCC25923耐藥突變株的選擇，而藥物濃度位于MSW外時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)耐藥突變株的選擇。(2)當(dāng)左氧氟沙星組織

8、液濃度位于MSW內(nèi)的下半部時(shí)，最容易導(dǎo)致耐藥突變株的選擇。(3)當(dāng)使組織籠內(nèi)左氧氟沙星濃度高于MPC的時(shí)間占整個(gè)治療時(shí)間的百分比T＞MPC(％)保持在16.7％以上時(shí)，可有效地防止ATCC25923耐藥突變株在體內(nèi)的選擇性富集擴(kuò)增；當(dāng)左氧氟沙星組織液Cmax高于MIC99但又不能超過(guò)MPC時(shí)，藥物濃度在MSW內(nèi)的時(shí)間占整個(gè)治療時(shí)間的百分比Tmsw(％)超過(guò)16.7％，就可導(dǎo)致耐藥突變株在體內(nèi)的選擇性富集擴(kuò)增；而當(dāng)藥物濃度在整個(gè)用藥期間均

9、低于MIC99時(shí)，不會(huì)導(dǎo)致耐藥突變株的選擇性富集。(4)當(dāng)組織籠內(nèi)左氧氟沙星Cmax/MIC≥8，或AUC0-24/MIC＞250或AUC0-24/MPC＞40時(shí)，可有效防止耐藥的發(fā)生。 第三部分：(1)結(jié)核患者前鼻腔金黃色葡萄球菌攜帶率為16.9％。在入選的58例患者中，治療4周時(shí)的細(xì)菌清除率為91.4％，5例仍然有前鼻腔定植的患者，其定植菌株均為RFP耐藥菌株，耐藥發(fā)生率為8.6％。spa和PFGE分型表明治療前后分離的菌株

10、為同一型。(2)對(duì)照組糖尿病患者前鼻腔金黃色葡萄球菌攜帶率為20.5％，觀察期間無(wú)耐藥株出現(xiàn)。 第四部分結(jié)核病和糖尿病患者前鼻腔所攜帶的金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素和紅霉素以外的多數(shù)抗菌藥物敏感。 結(jié)論：(1)對(duì)于金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC25923同源耐藥突變株及臨床分離的金黃色葡萄球菌，莫西沙星和加替沙星限制下一步耐藥突變株選擇的能力優(yōu)于帕珠沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星。(2)FQ藥物濃度對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥

11、突變株恢復(fù)生長(zhǎng)菌落數(shù)和耐藥位點(diǎn)的選擇都有明顯的影響。(3)結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)于環(huán)丙沙星或左氧氟沙星耐藥的金黃色葡萄球菌，莫西沙星和加替沙星不能限制下一步耐藥突變株的選擇。(4)從動(dòng)物體內(nèi)水平證明當(dāng)組織籠內(nèi)左氧氟沙星濃度高于MPC時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)耐藥突變株的選擇性富集；當(dāng)藥物濃度低于MIC99時(shí)，也不會(huì)導(dǎo)致耐藥突變株的選擇性富集；當(dāng)藥物Cmax不能達(dá)到MPC，并且大部分時(shí)間位于MSW內(nèi)時(shí)，很容易導(dǎo)致耐藥突變株的體內(nèi)選擇并導(dǎo)致耐藥。(5)體