金黃色葡萄球菌適應(yīng)性耐藥及MRSA耐藥調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是人體皮膚和鼻腔的常見(jiàn)定植菌,同時(shí)也是引起臨床感染的常見(jiàn)致病菌,既可引起局部化膿性感染,如癤、癰、毛囊炎、甲溝炎和外科切口、創(chuàng)傷等局部化膿性感染,也可引起肺炎、骨髓炎、腦膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及膿毒癥、敗血癥等全身性感染。隨著抗生素廣泛應(yīng)用于臨床,金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn),并且呈現(xiàn)多重耐藥性。金黃色葡萄球菌耐藥性的獲得,一方面可以通過(guò)細(xì)菌自身表型的改變、代謝通路的調(diào)整等,對(duì)抗生素產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥(adaptive

2、resistance),如金黃色葡萄球菌生物被膜的產(chǎn)生、形成小菌落、細(xì)胞壁增厚以及持留菌的產(chǎn)生都可以對(duì)抗生素產(chǎn)生較高的耐藥性;另一方面,金黃色葡萄球菌可以通過(guò)水平轉(zhuǎn)移等方式獲得耐藥基因,如金黃色葡萄球菌獲得產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶基因后即可呈現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。自1961年發(fā)現(xiàn)第一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)以來(lái),MRSA在臨床的感染率

3、和分離率不斷增加,并且在世界范圍內(nèi)廣泛傳播,成為全球院內(nèi)感染的首要病原菌。MRSA的耐藥機(jī)制主要為細(xì)菌獲得一耐藥島,該耐藥島上含有一個(gè)重組酶簇和一個(gè)耐藥決定簇。在耐藥決定簇上的mecA基因可以編碼產(chǎn)生一種新的青霉素結(jié)合蛋白(penicillinbindingprotein,PBP),稱為PBP2a,其轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域(TPasedomain)與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低,當(dāng)正常PBPs被抗菌藥物結(jié)合而失去活性時(shí),PBP2a能夠代替其功能

4、,繼續(xù)肽聚糖合成,維持MRSA菌的生長(zhǎng)和成活,呈現(xiàn)出高度耐藥性。
　　一般認(rèn)為,在沒(méi)有抗生素選擇壓力下,mecA基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平是受到嚴(yán)格控制的。位于mecA基因的啟動(dòng)子上游有一對(duì)基因mecR1-mecI調(diào)控mecA的表達(dá)。耐藥決定簇mecI所編碼產(chǎn)生的MecI阻遏蛋白結(jié)合在mecA基因的啟動(dòng)子部位,使得mecA基因表達(dá)處于抑制狀態(tài),但是當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境中存在相關(guān)抗生素(如青霉素、頭孢西丁等)時(shí),抗生素一方面攻擊正常PBPs的轉(zhuǎn)肽酶

5、功能域,使其失去活性而喪失合成細(xì)菌細(xì)胞壁的功能,另一方面可以作為誘導(dǎo)劑,與分布在細(xì)菌胞膜上的由mecR1基因編碼的MecR1蛋白相結(jié)合,使其發(fā)生自裂解而發(fā)揮肽酶活性,分解結(jié)合在mecA啟動(dòng)子上的阻遏蛋白MecI,從而啟動(dòng)mecA的表達(dá),產(chǎn)生PBP2a,代替PBP2的轉(zhuǎn)肽酶活性,繼續(xù)金黃色葡萄球菌肽聚糖的合成,維持MRSA耐藥性。最新的研究顯示在mecI基因的下游還有個(gè)mecR2基因,mecR2與mecR1-mecI組成了一個(gè)三組分系統(tǒng)調(diào)

6、控mecA基因的轉(zhuǎn)錄,mecR2所編碼的蛋白MecR2可以通過(guò)與MecI直接的相互作用,使得MecI穩(wěn)定性下降,并最終導(dǎo)致MecI蛋白的鈍化和降解。
　　然而分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在MRSA耐藥島上的耐藥決定簇(meccomplex)可由于插入序列(IS431,IS1272)的插入,導(dǎo)致mecR1或/和mecI基因被外源序列插入而失活,mecA表達(dá)不受限制,即有的金黃色葡萄球菌中耐藥分子PBP2a處于持續(xù)組成型表達(dá)狀態(tài),并且,最新

7、的研究表明,mecA的持續(xù)表達(dá)與金黃色葡萄球菌耐藥水平無(wú)線性對(duì)應(yīng)關(guān)系,即PBP2a的存在與MRSA的耐藥性表現(xiàn)不是完全對(duì)應(yīng),MRSA的耐藥性表現(xiàn)需要PBP2a存在,但并不是有PBP2a存在,金黃色葡萄球菌就一定表現(xiàn)出耐藥性。GiannouliS等對(duì)金黃色葡萄球菌臨床分離株進(jìn)行了檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)菌株中存在mecA基因,且能正常表達(dá),但這些菌株仍表現(xiàn)出對(duì)甲氧西林敏感,強(qiáng)烈提示PBP2a在介導(dǎo)金黃色葡萄球菌耐藥性時(shí)還受著某些未知調(diào)控因素的影響。

8、一般,一個(gè)蛋白質(zhì)分子功能的發(fā)揮,基因水平的調(diào)控只是第一步,決定著相應(yīng)的蛋白分子是否表達(dá),而蛋白質(zhì)分子表達(dá)后是否發(fā)揮出相應(yīng)的生物學(xué)功能,還取決于蛋白質(zhì)水平的影響因素,且這種調(diào)控可能是更直接的。在我們前期的工作中,我們以金黃色葡萄球菌PBP2a分子的轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌,通過(guò)細(xì)菌雙雜交技術(shù)從耐藥金黃色葡萄球菌N315基因組表達(dá)文庫(kù)中篩選到一與PBP2a相互作用的小肽(40aa),體外pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)該小肽能與PBP2a直接相互作用。

9、生物信息學(xué)檢索顯示,該小肽為耐藥金黃色葡萄球菌N315基因組上的一個(gè)未注釋的新基因所編碼,命名為pbpR。我們推測(cè)PBPR可能通過(guò)與PBP2a的直接相互作用從而在介導(dǎo)MRSA的耐藥性中發(fā)揮重要作用。
　　本論文第一部分,對(duì)我們課題組在MRSA流行病學(xué)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一些可能為適應(yīng)性耐藥臨床分離菌株進(jìn)行深入研究,探討MRSA菌對(duì)抗生素產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥的可能機(jī)制。另外為了闡明PBPR與PBP2a介導(dǎo)的耐藥性的關(guān)系,本文采用RT-PCR的

10、方式證實(shí)pbpR基因在N315中是表達(dá)的;通過(guò)細(xì)菌雙雜交技術(shù)證實(shí)PBPR全長(zhǎng)蛋白(63aa)與PBP2a具有相互作用;利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建pbpR基因缺失突變株,檢測(cè)突變株的耐藥性變化,以明確PBPR對(duì)PBP2a介導(dǎo)耐藥性的調(diào)控作用。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面:
　　1.金黃色葡萄球菌對(duì)阿米卡星適應(yīng)性耐藥研究
　　(1)臨床分離株CY001和CY002基因分型及生長(zhǎng)特性研究:通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳、多位點(diǎn)序列分析、金黃色

11、葡萄球菌染色體盒mec元件分型,金黃色葡萄球菌表面蛋白A多變區(qū)分型等基因分型技術(shù)手段證實(shí)從同一個(gè)病人不同時(shí)期,分離自不同部位的MRSA菌CY001和CY002具有一致的基因分型;CY001和CY002具有相似的耐藥譜,但是CY001對(duì)阿米卡星耐藥(MIC64μg/ml),CY002對(duì)阿米卡星敏感(MIC8μg/ml);PCR結(jié)果顯示兩株菌均不攜帶阿米卡星耐藥基因;CY001在阿米卡星的壓力下,生長(zhǎng)曲線會(huì)發(fā)生滯后現(xiàn)象,考慮CY001對(duì)阿米

12、卡星的耐藥為適應(yīng)性耐藥。
　　(2)臨床分離株CY001和CY002細(xì)胞表型及相關(guān)基因表達(dá)變化研究:透射電子顯微鏡結(jié)果顯示CY001在阿米卡星MIC壓力下,細(xì)胞壁會(huì)增厚2倍左右,并且隨著抗生素濃度增高,細(xì)胞壁增厚程度加劇,在細(xì)胞壁增厚的過(guò)程中,肽聚糖合成關(guān)鍵酶的編碼基因pbpB表達(dá)明顯上調(diào),這就提示CY001對(duì)阿米卡星的耐藥可能是通過(guò)細(xì)胞壁增厚的機(jī)制產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥。并且在體外,通過(guò)梯度抗生素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),成功的從阿米卡星敏感菌株CY0

13、02中篩選到一株與耐藥菌CY001相似的耐藥菌,該誘導(dǎo)菌在抗生素壓力下也會(huì)發(fā)生細(xì)胞壁增厚。
　　(3)本部分研究顯示細(xì)胞壁增厚是金黃色葡萄球菌對(duì)阿米卡星產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥的可能機(jī)制。
　　2.PBPR對(duì)PBP2a介導(dǎo)MRSA耐藥性的調(diào)控作用研究
　　(1)pbpR在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的研究:RT-PCR實(shí)驗(yàn)中,我們用P2-R引物對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,而后進(jìn)行PCR,可以擴(kuò)增出大小為225bp的片段,此時(shí)檢測(cè)的應(yīng)為負(fù)鏈上的pbpR基

14、因,這表明在RNA水平,pbpR基因是有表達(dá)的。
　　(2)PBPR與PBP2a相互作用的驗(yàn)證:完整的pbpR基因克隆并構(gòu)建到rPAC質(zhì)粒上,后轉(zhuǎn)化入含有誘餌質(zhì)粒pBR-PBP2a的KS1細(xì)菌中,通過(guò)細(xì)菌雙雜交技術(shù)驗(yàn)證PBPR與PBP2a的相互作用,結(jié)果顯示完整的PBPR與PBP2a在細(xì)菌雙雜交體系中具有相互作用。
　　(3)pbpR基因敲除突變株的構(gòu)建:以N315基因組DNA為模板,PCR分別擴(kuò)增pbpR基因的上下游片段;

15、同時(shí)以pSET16穿梭質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因cat,在限制性內(nèi)切酶和T4連接酶的作用下,分別將它們依次克隆到pYT3載體的多克隆位點(diǎn)上,形成靶基因敲除載體pYT3::pbpR。將敲除載體電轉(zhuǎn)化至N315感受態(tài)細(xì)菌,篩選具有氯霉素抗性的N315菌落。通過(guò)PCR初篩和多重PCR復(fù)篩的方法獲得pbpR基因敲除突變株。
　　(4)pbpR基因缺失前后細(xì)菌耐藥性的差異:我們通過(guò)瓊脂稀釋法及藥敏紙片法測(cè)定pbpR基因敲除后

16、N315對(duì)苯唑西林的耐藥性。結(jié)果表明pbpR基因缺失會(huì)導(dǎo)致MRSAN315菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素(如苯唑西林)的耐藥性降低。
　　綜上所述,本課題實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞壁增厚可能是臨床MRSA菌株對(duì)阿米卡星適應(yīng)性耐藥的機(jī)制。另外我們通過(guò)細(xì)菌雙雜交技術(shù)成功地篩選到一與MRSA耐藥主要因子PBP2a相互作用的分子PBPR,RT-PCR證實(shí)pbpR在轉(zhuǎn)錄水平有表達(dá),并通過(guò)基因敲除技術(shù)獲得了pbpR基因缺失突變株,藥敏實(shí)驗(yàn)顯示pbpR基因的缺失,