金黃色葡萄球菌GapC蛋白的表達與免疫原性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus，S. aureus)是引起人和動物多種疾病的重要致病菌。由于不同S. aureus菌株間缺乏共同的保護性抗原，目前研究的S. aureus疫苗在臨床試驗中應用效果并不理想。研究表明甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白可作為抗寄生蟲和微生物感染的疫苗抗原。因而，本研究利用S. aureus表面具有GAPDH活性的保守性GapC蛋白制備免疫原，探討其免疫原性，及其對S.aure

2、us感染的免疫保護作用。 本研究首先通過PCR方法擴增S.aureus菌株。BMSA/855/23-1的gapC基因，隨后將其克隆到pMD18-T載體上。重組克隆pMD-T/gapC經測序后，與GenBank上已發(fā)表的序列進行對比分析。然后，將gapC基因插入到pQE-30載體上，構建重組質粒pQE30/gapC。重組質粒轉化大腸桿菌E.coliM15(pREP4)，IPTG誘導后，SDS-PAGE鑒定GapC融合蛋白的表達。重

3、組蛋白經純化后進行GAPDH活性檢測和Western blot檢測，確定其GAPDH活性及特異性抗體結合活性。25只健康家兔隨機分成5組，分別用重組蛋白、全菌體滅活菌苗及對照劑(PBS)對其進行免疫。應用ELISA方法檢測血清中l(wèi)gG抗體水平及加強免疫第14d血清中IFN-γ、IL-4細胞因子濃度。最后，用S.aureus菌株Wood46對免疫兔攻毒，觀察攻毒后家兔的臨床癥狀、病理變化，對試驗兔的肝、脾及腎臟進行細菌分離鑒定，確定其發(fā)病

4、情況，進而評價GapC蛋白的免疫保護效果。 結果本研究成功擴增并克隆了S.aureus BMSA/855/23-1株的gapC基因，該菌株的gapC基因與GenBank上S.aureus BM10株的核苷酸序列一致性為99.3％，推導氨基酸序列一致性為99.4％。SDS-PAGE結果表明，重組質粒pQE30/gapC在E.coli M15(pREP4)中成功表達，GAPDH活性檢測及Western Blot檢測表明重組蛋白具有較

5、高的GAPDH活性和抗原性。GapC蛋白及全菌體組兔血清中抗IgG抗體水平在加強免疫后第28d達到最高(1：64000)。加強免疫后第14d血清中細胞因子IFN-γ和IL-4濃度與對照組相比，顯著升高(p<0.05)；而全菌體免疫組細胞因子濃度升高不明顯(p>0.05)。在加強免疫第10d，用5×10<'7>CFU/mL .S. aureus對家兔進行攻毒，結果蛋白免疫組家兔中僅有1只家兔發(fā)病(1/5)。 以上結果表明，表達的重