金黃色葡萄球菌表面多糖偶聯(lián)抗原的制備及其免疫原性分析.pdf

1、金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎以及醫(yī)院臨床感染的主要病原，對(duì)該菌感染的防治主要采用抗生素進(jìn)行治療。然而，長(zhǎng)期、大量的抗生素應(yīng)用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)和蔓延，使防治難度不斷加大。此外，用抗生素治療奶牛乳房炎還存在奶產(chǎn)品抗生素殘留，影響食品安全。研制和開發(fā)有效疫苗，通過免疫接種進(jìn)行金黃色葡萄球菌感染的預(yù)防已成為近年來研究的熱點(diǎn)。
　　 表面多糖（CP5、CP8和336PS）是金黃色葡萄球菌的主要共同性抗原成分和毒力因子，也是疫苗開發(fā)的主要

2、靶抗原。該類多糖的分子量小，免疫原性差，通過技術(shù)方法改善其免疫原性對(duì)于研制有效疫苗至關(guān)重要。本研究分別對(duì)金黃色葡萄球菌的3種重要表面多糖進(jìn)行了提取、純化、蛋白載體偶聯(lián)和偶聯(lián)抗原的免疫原性研究。
　　 首先采用高壓破碎法使莢膜多糖CP5和CP8從金黃色葡萄球菌菌體釋放，選用不同的酶處理去除破碎產(chǎn)物中的核酸和蛋白，再通過離子交換層析獲得一定純度的CP5、CP8莢膜多糖。表面多糖336PS的獲取則采用溶葡萄球菌酶消化法使其從菌體釋放，

3、梯度乙醇浸提和不同酶的消化進(jìn)行粗提，再通過凝膠層析純化，得到了一定純度的336PS多糖。
　　 研究建立了金黃色葡萄球菌表面多糖的化學(xué)檢定方法。檢測(cè)結(jié)果表明，CP5、CP8、336PS的純度分別為67.51%、63.83%和68.51%；用免疫瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)，純化的多糖僅與抗同型菌株免疫血清發(fā)生沉淀反應(yīng)。
　　 研究制備了3種表面多糖的蛋白偶聯(lián)抗原，并對(duì)偶聯(lián)抗原的免疫原性進(jìn)行了檢測(cè)。將純化表面多糖通過ADH間橋法和E

4、DAC零距離交聯(lián)法與BSA偶聯(lián)，凝膠過濾層析純化，紫外掃描鑒定，從檢定波長(zhǎng)判定偶聯(lián)成功。分別制備了6種表面多糖偶聯(lián)抗原的油佐劑亞單位疫苗免疫小鼠，并以同樣的方式制備3種未偶聯(lián)表面多糖、PBS疫苗做對(duì)照。分別在免疫前，免疫第14 d和第28 d采集各組免疫小鼠血，分離血清，用間接ELISA檢測(cè)血清中針對(duì)抗表面多糖的抗體水平。檢測(cè)結(jié)果表明：2種偶聯(lián)方法制備的抗原都能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而未偶聯(lián)的多糖則無免疫原性。
　　

5、 為了解該抗體的的免疫保護(hù)性，在第28 d加強(qiáng)免疫一次，7天后后腿外側(cè)注射同型菌株，觀察小鼠后腿外側(cè)臨床病理變化并進(jìn)行臨床指數(shù)評(píng)分。攻毒實(shí)驗(yàn)表明，偶聯(lián)抗原組能夠?qū)γ庖咝∈筇峁┹^好的免疫保護(hù)作用。經(jīng)綜合分析，ADH間橋法制備的CP5-BSA、CP8-BSA和336PS-BSA偶聯(lián)抗原免疫效果優(yōu)于EDAC零距離交聯(lián)法。
　　 為克服載體蛋白BSA在奶牛免疫中免疫原性差的問題，采用基因工程方法，通過PCR擴(kuò)增綠膿桿菌外毒素A基因（ET

6、A），構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-ETA，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒pET-28a-ETA并進(jìn)行雙酶切、PCR鑒定及測(cè)序鑒定。用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和western blotting分析，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定目的蛋白分布，最終批量進(jìn)行表達(dá)。采用尿素對(duì)包涵體進(jìn)行變性并確定最佳的復(fù)性條件和復(fù)性緩沖液，Ni-NTA樹脂柱上復(fù)性目的蛋白。柱上復(fù)性后目的蛋白的純度達(dá)到93%以上。