金黃色葡萄球菌蛋白A的原核表達(dá)及生物親和性研究.pdf

1、目的: 1．用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)金黃色葡萄球菌蛋白 A，為研發(fā)免疫球蛋白純化試劑、免疫學(xué)檢測(cè)試劑等產(chǎn)業(yè)化商品奠定基礎(chǔ)； 2．優(yōu)化重組蛋白SPA在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)條件，并探討有突變及8個(gè)氨基酸殘基缺失的重組蛋白SPA生物親和性變化。 實(shí)驗(yàn)方法: 1．SPA原核表達(dá)和鑒定 1．1 目的基因的選擇：選擇金黃色葡萄球菌的spa基因（NCTC8325株73429-74979bp），參考文獻(xiàn)選擇E、D、

2、A、B、C五個(gè)結(jié)合功能域及X結(jié)構(gòu)域片段，共1320bp。 1．2 擴(kuò)增目的基因、構(gòu)建克隆載體：根據(jù)spa基因序列在Primer5的輔助下設(shè)計(jì)引物。以金黃色葡萄球菌ATCC25923株基因組DNA為模板，PCR方法擴(kuò)增目的基因，連接于pMD18-T載體獲得克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10細(xì)胞，PCR鑒定陽(yáng)性克隆。 1．3 SPA表達(dá)載體的構(gòu)建：提取pMD18-T-SPA克隆質(zhì)粒，與表達(dá)載體pET-30a同時(shí)以NdeⅠ

3、、XhoⅠ雙酶切，回收目的片段構(gòu)建表達(dá)載體pET-30a-SPA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），PCR及雙酶切鑒定并委托測(cè)序。 1．4 SPA重組蛋白的表達(dá)：挑取含重組載體的BL21（DE3）單克隆，終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5．5h，14000g/min離心5min收集菌體，SDS-PAGE法分析重組蛋白SPA表達(dá)情況。 1．5表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及表達(dá)條件的優(yōu)化：應(yīng)用Western-blot方法鑒定目的蛋白，改變培

4、養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、不同濃度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體SDS-PAGE法分析重組蛋白SPA最佳表達(dá)條件，在初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上分析大量表達(dá)的最佳條件。 2．重組蛋白SPA生物親和性研究 2．1 重組蛋白SPA的純化：取含有重組載體的BL21（DE3）單克隆于Kana+LB培養(yǎng)基、30℃、終濃度為1mM的IPTG過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)后14000g/min離心5min收集菌體。將菌體沉淀用結(jié)合液重懸，超聲破碎細(xì)胞，應(yīng)用His親和

5、層析純化柱純化目的蛋白，SDS-PAGE分析純度。 2．2 SPA與多種屬球蛋白親性比較：以重組蛋白SPA包被酶標(biāo)板，健康豬、人、山羊、兔、小鼠血清作為檢測(cè)試劑，應(yīng)用HRP標(biāo)記的相應(yīng)特異二抗-TMB顯色系統(tǒng)獲取A值，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析重組蛋白SPA的生物親和特性。 3．靈敏度及特異性研究 3．1 HRP標(biāo)記重組蛋白SPA：應(yīng)用過(guò)碘酸鈉法將HRP偶聯(lián)到純化的SPA上。 3．2 靈敏

6、度分析：包被不同量人源IgG抗體，同時(shí)用SPA-HRP及羊抗人IgG-HRP檢測(cè)，分析SPA-HRP檢測(cè)IgG的靈敏度。 3．3 特異性分析：純化后重組蛋白SPA包被酶標(biāo)板，健康人血清及山羊抗人IgM-HRP、山羊抗人IgG-HRP為檢測(cè)試劑，分析SPA與人源免疫球蛋白IgG結(jié)合的特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1．SPA在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到表達(dá) 1．1 獲得目的基因、構(gòu)建了克隆載體pMD18-T-SPA：PC

7、R方法獲得SPA E、D、A、B、C功能域及X結(jié)構(gòu)域1320bp核酸序列，菌液PCR鑒定成功構(gòu)建了pMD18-T-SPA克隆質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果顯示目的基因序列與當(dāng)前人們普遍才采用的與CowanⅠ株（Genbank M18264．1）比較，存在5個(gè)堿基突變（第371位C→T；第924位T→C；第934、935位G→A；第942位A→G），1075-1098（或1099-1122）缺失，氨基酸比對(duì)有2個(gè)氨基酸殘基突變（124A→V；312 G→

8、N）以及377-384氨基酸的缺失（由于X結(jié)構(gòu)域存在多個(gè)重復(fù)序列，所以在推算過(guò)程中缺失序列可以處在不同的位置）。與Genbank H7531分離株（AM407348．1）比較，存在8個(gè)堿基突變（第371位C→T；第1005、1077位T→C；第1035位C→A；第1030、1031、1038、1044、1062位G→A），氨基酸比對(duì)有3個(gè)殘基突變（第124位A→V；第344位G→N；第345位N→K）。 1．2 構(gòu)建了表達(dá)載體p

9、ET-30a-SPA：pET-30a-SPA經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，電泳顯示在5234bp、1320bp左右獲得2條電泳帶，大小與載體和目的DNA片段長(zhǎng)度相符。 1．3 SPA重組蛋白的表達(dá)：挑取含重組載體的BL21（DE3）單克隆IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE顯示：陽(yáng)性菌與陰性對(duì)照比較在46kD大小處出現(xiàn)條帶，與目的蛋白大小一致；在35kD大小處的條帶也有一條條帶，可能為目的蛋白降解產(chǎn)物。 1．4 表達(dá)產(chǎn)物的鑒

10、定及表達(dá)條件的初步優(yōu)化：Western-blot結(jié)果顯示，重組蛋白SPA得到了表達(dá)，但是存在降解現(xiàn)象。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，將宿主菌在不同濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下表達(dá)量沒(méi)有明顯改變；不同誘導(dǎo)時(shí)間分析表明5-6h重組蛋白SPA表達(dá)量最高；不同培養(yǎng)基分析DMEM培養(yǎng)基能明顯減低目的蛋白的降解；誘導(dǎo)溫度在25℃、25℃、30℃時(shí)蛋白降解也相對(duì)較低，在30℃條件下過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)蛋白顯示蛋白降解量較低，菌體產(chǎn)量高，表達(dá)量占菌體總量的26％左右，因

11、此可以作為大量表達(dá)的條件。 2．重組蛋白SPA生物親和性研究 2．1 重組蛋白SPA的純化：應(yīng)用His親和層析純化柱成功的獲得了純度約99％的重組蛋白SPA。 2．2 生物親和性研究：ELISA實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白SPA與人、小鼠源IgG有較高親和性，而與豬、兔源IgG有親和性較弱分別為小鼠的33．4％和31．5％，SPA與山羊源IgG未檢測(cè)到親和性，其A值與空白對(duì)照差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0．05。 3．

12、靈敏度及特異性研究 3．1 靈敏度分析：ELISA方法顯示，SPA-HRP、羊抗人IgG-HRP均能檢測(cè)到最低1ng水平的人源IgG，P/N值分別為2．612和2．8，表面兩者在檢測(cè)人源IgG時(shí)靈敏度相近。 3．2 特異性分析：ELISA方法分析顯示，羊抗人IgG-HRP組A值與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而羊抗人IgM-HRP組A值與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0．05值，表明該重組蛋白SPA與人源IgG親和力較高