金黃色葡萄球菌Fe攝取調(diào)節(jié)蛋白SirA的原核表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文金黃色葡萄球菌Fe攝取調(diào)節(jié)蛋白SirA的原核表達(dá)及其功能的初步研究姓名：舒燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：朱國(guó)強(qiáng)201106揚(yáng)州人學(xué)碩學(xué)位論文II一質(zhì)膜外部能夠捕獲結(jié)合了鐵的鐵載體。本試驗(yàn)擬以sirABC操縱子編碼的SirA蛋白與鐵載體的結(jié)合為研究對(duì)象，通過(guò)PCR擴(kuò)增出＆aureus基因組DNA中sirA基因，對(duì)該基因片段進(jìn)行回收，將其連接到pColdTMTF冷凍表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)

2、感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SirATF重組蛋白，采用蛋白純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化后測(cè)定重組蛋白濃度，免疫ICR小鼠制備SirATF重組蛋白多抗血清，應(yīng)用問(wèn)接ELISA方法測(cè)定免疫鼠血清抗體效價(jià)；用WesternBlot檢測(cè)含不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下SirA蛋白的表達(dá)情況；分別用純化的SirA蛋白、滅活的Saureus菌體和無(wú)菌PBS溶液免疫小鼠，共三次免疫，在第三免7天后，分別用101、108、109CFU的活金葡菌進(jìn)行小鼠鼻腔定植

3、，定植七天后處死小鼠，剪下鼻腔組織進(jìn)行鼻腔活菌總數(shù)測(cè)定。設(shè)計(jì)了試驗(yàn)探討SirA多抗血清對(duì)Saureus生長(zhǎng)的影響和sirA在Saureus致病過(guò)程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出sirA基因并將其連到表達(dá)載體pColdTMTF中。SDSPAGE結(jié)果表明重組質(zhì)粒pColdTMTFsirA能夠在EcolfBL21(DE3)@成功誘導(dǎo)和高效表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白是可溶性的。用重組蛋白免疫小鼠后制備的多抗血清抗體水平在加強(qiáng)免疫第二周達(dá)到1：6

4、4000；WestemBlot檢測(cè)表明，當(dāng)金黃色葡萄菌在鐵限制性培養(yǎng)條件下(大豆胰蛋白胨肉湯600“M22聯(lián)吡啶)SirA蛋白量表達(dá)比在富鐵培養(yǎng)下培養(yǎng)(大豆胰蛋白胨肉湯50州FeCl3)要高。鼻腔定植試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠在三免后7天，SirA蛋白免疫組(228333士41186)對(duì)Saureus的粘附阻斷能力優(yōu)于滅活Saureus免疫組(4420002140897)(P005)，并且顯著高于PBS對(duì)照組(1020333士129693)(P

5、001)；在第十四天，SirA蛋白免疫組(61000110535)對(duì)Saureus的粘附阻斷能力優(yōu)于PBS對(duì)照組(168333土36746)(P001)?？贵w抑制試驗(yàn)表明，在缺鐵條件下不同稀釋的SirA多抗能夠有效的降低Saureus的生長(zhǎng)，而在富鐵條件下此種作用效果不如在缺鐵培養(yǎng)下明顯。綜上所述，sirA基因在pColdTMTF冷凍表達(dá)載體中能夠大量表達(dá)可溶性重組蛋白，且表達(dá)的重組SirA蛋白具有較好的免疫原性及免疫保護(hù)作用，為將來(lái)成