AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rsp對金黃色葡萄球菌毒力的調(diào)節(jié)及機制.pdf

1、革蘭陽性菌特別是金黃色葡萄球菌是目前醫(yī)院感染最常見的病原體之一，可引起多種人類疾病，包括化膿性炎癥，如傷口化膿、骨、關(guān)節(jié)的感染，也可引起內(nèi)臟器官的感染，如肺炎、膿胸、中耳炎、心包炎、心內(nèi)膜炎等;另外嚴(yán)重者可引起全身感染如敗血癥、膿毒血癥等[1]。隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨之增加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趨勢[2]。特別是1999-2000年，高致病力社區(qū)來源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌出

2、現(xiàn)，主要引起嚴(yán)重的敗血癥以及致死性肺炎等，感染者死亡率明顯增高[3]。由于其高致病力和高致死率，國際上將其作為繼HIV之后第二大危及人類生命的病原微生物，其毒力因子及致病機理是目前國際各研究部門研究熱點。
　　金黃色葡萄球菌毒力因子的表達(dá)受一系列調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控，其中最重要的一個系統(tǒng)是agr系統(tǒng)（附屬基因調(diào)節(jié)子），它調(diào)控大多數(shù)胞外蛋白的表達(dá)，并且可以通過細(xì)胞濃度依賴性機制調(diào)節(jié)多種毒力基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)菌的致病性[4]。同時，金黃色葡

3、萄球菌的毒力也受sarA，sae，sarS和rot等基因的調(diào)節(jié)[5]。金黃色葡萄球菌的毒力是多因素調(diào)控的，這些調(diào)控因素之間的相互關(guān)系以及整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要進(jìn)一步研究。金黃色葡萄球菌外分泌型毒素—溶血素是其最重要的毒素之一。目前對金黃色葡萄球菌溶血素表達(dá)調(diào)控的具體機制尚存在諸多的不清楚。因此從全基因組水平全面了解對金黃色葡萄球菌溶血素表達(dá)有明顯調(diào)節(jié)作用的基因，明確其對細(xì)菌毒力具體的調(diào)節(jié)作用以及機制，補充和完善金黃色葡萄球菌毒力因子的調(diào)控網(wǎng)

4、絡(luò)，為高致病力金黃色葡萄球菌如何引起疾病的毒力調(diào)節(jié)通路提供新的實驗依據(jù)。
　　第一部分 轉(zhuǎn)座子插入突變文庫的建立及篩選
　　目的:構(gòu)建轉(zhuǎn)座子隨機插入突變庫，并篩選出對溶血功能有明顯調(diào)節(jié)作用的基因。方法:使用本實驗室構(gòu)建并已申請國家專利的真核轉(zhuǎn)座酶為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建BD02-25轉(zhuǎn)座子隨機插入突變文庫，通過用5％羊血平板篩選出與野生株相比溶血明顯改變的克隆，接著運用隨機引物反向PCR和測序等方法鑒定出突變基因。結(jié)果:在BD0

5、2-25中建立了一個庫容量約為104個克隆的轉(zhuǎn)座子隨機插入突變文庫，篩選并確定溶血能力較野生株明顯改變的插入突變株。運用隨機引物反向PCR和測序等方法鑒定出突變基因，運用生物信息學(xué)方法分析這些基因的可能功能。其中25株α毒素表達(dá)明顯下降的突變菌株中，有4株克隆轉(zhuǎn)座子分別插入到AraC/XylS家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(SAUSA3002326)的4個不同位置均導(dǎo)致溶血功能明顯下降。經(jīng)鑒定，此轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因編碼的蛋白（701個氨基酸）與金黃色葡萄球

6、菌中生物膜調(diào)節(jié)基因rsp編碼的蛋白有99％的同源性，因此可判定為同一基因。結(jié)論:AraC/XylS家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因rsp可調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌的溶血功能。
　　第二部分 AraC/XylS家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rsp的功能研究
　　目的:研究AraC/XylS家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rsp在金黃色葡萄球菌的功能。方法:使用PKOR1質(zhì)粒通過同源重組方法構(gòu)建金黃色葡萄球菌BD02-25 rsp基因突變株，用PRB473質(zhì)粒獲得rsp基因互補表

7、達(dá)株，并繪制野生株、突變株、互補表達(dá)株生長曲線。通過半定量生物膜實驗分析rsp基因敲除前后對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。接著通過小鼠菌血癥與皮膚膿腫模型實驗對其編碼蛋白的功能進(jìn)行研究。之后使用RNA-sequence方法觀察指數(shù)生長后期相同CFU的野生株與突變株表達(dá)譜的差異，并用定量RT-PCR方法驗證RNA-sequence的結(jié)果。結(jié)果:生長曲線表明rsp基因突變株的生長稍慢于野生株與互補表達(dá)株，但24小時后生長無明顯差異。半定量

8、生物膜實驗表明rsp可下調(diào)生物膜的形成。小鼠菌血癥模型實驗中，rsp基因突變株的生存百分率明顯高于野生株，小鼠皮膚膿腫模型實驗中，野生株的膿腫面積明顯大于rsp基因突變株。RNA-sequence結(jié)果提示，rsp可以上調(diào)多種基因（溶血毒素hla，hld，hlg，蛋白酶sspA，sspB和sspC以及調(diào)節(jié)基因agrD，sarR等）的表達(dá)，也可下調(diào)多種基因(sasG，ure，icaA以及蛋白酶基因atl等)的表達(dá)。定量RT-PCR驗證了RN

9、A-sequence的結(jié)果，即rsp對細(xì)菌毒力因子(hla，RNAⅢ及PSM)的表達(dá)有上調(diào)作用，而對細(xì)菌生物膜形成相關(guān)基因（icaA）及代謝相關(guān)因子的表達(dá)有下調(diào)作用。結(jié)論:AraC/Xyls家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rsp可上調(diào)金黃色葡萄球菌毒力的表達(dá)。
　　第三部分 Rsp蛋白調(diào)控金黃色葡萄球菌毒力的機制研究
　　目的:研究AraC/XylS家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rsp對金黃色葡萄球菌毒力的調(diào)節(jié)機制。方法:誘導(dǎo)表達(dá)并純化含DNA結(jié)合域的R