白藜蘆醇對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌作用及機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是植物遇真菌侵襲時(shí)分泌的一種植物防御成分,屬天然多酚類物質(zhì)。1940年從植物白藜蘆根莖里提取并命名為Resveratrol。含RES的植物資源豐富,葡萄藤、虎杖等植物都可加工提純RES,廢棄植物如花生根、葡萄皮等也含有RES。RES具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心血管疾病、抗氧化、抗病毒等多種生物學(xué)活性,對(duì)多種微生物也具有抑制作用,但抑菌機(jī)制尚不明確。幾十年來,臨床病原菌耐藥性不斷增加,尤其是多

2、重耐藥的金黃色葡萄球菌讓臨床醫(yī)師選擇抗生素難上加難,副作用小且價(jià)格低廉的中藥可作為輔助藥物供臨床選擇。本研究選用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923(簡(jiǎn)稱金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株)作為研究主體,通過觀察分析RES作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后,其最低抑菌濃度、生長曲線、細(xì)胞膜通透性、超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)的變化,研究RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株抑菌作用及抑菌機(jī)制,為RES進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。
  方法:
  1 RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株最低抑菌濃度測(cè)定

3、和生長曲線觀察:
  本研究以金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)作為研究主體,以臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的M7-A5為標(biāo)準(zhǔn)方法,采用抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)的微量肉湯稀釋法,檢測(cè)RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC);通過繪制在含不同濃度RES培養(yǎng)液中金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的生長

4、曲線,觀察在不含RES、含DMSO和含RES為1/4 MIC,1/2 MIC,1MIC和2MIC濃度下的金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株生長情況,研究RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑制作用。
  2 RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞膜通透性的影響:
  2.1 RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株作用后培養(yǎng)液上清電導(dǎo)率數(shù)據(jù)分析LB肉湯接種金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株懸液,37℃搖床震蕩孵育,在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長前期,加入RES,得到含RES為1 MIC和2 MIC的培養(yǎng)液,不加RES組作為對(duì)照組,

5、繼續(xù)37℃搖床震蕩孵育,分別在作用0h、2h、4h、6h、7h、8h時(shí),取混勻培養(yǎng)液2ml,離心,取上清,稀釋,檢測(cè)上清的電導(dǎo)率,每個(gè)樣本檢測(cè)三次,取均值繪制曲線圖,分析在不同濃度RES作用下,金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液上清液電導(dǎo)率的變化。
  2.2 RES作用于金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后培養(yǎng)液在260 nm和280 nm處吸光度分析:LB肉湯接種等量金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液,37℃搖床震蕩孵育,在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期前,加入RES獲得含RES為1 MIC的培

6、養(yǎng)液,37℃搖床震蕩孵育,在0h、2h、4h、6h、7h、8h作用時(shí)間點(diǎn),分別取培養(yǎng)液2ml,以不加RES的培養(yǎng)液作對(duì)照,檢測(cè)培養(yǎng)液OD260,OD280的數(shù)據(jù)并比較分析。
  2.3 RES作用于金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后培養(yǎng)液在630 nm處吸光度變化分析:LB肉湯接種金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液,37℃搖床震蕩孵育,在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期前,加入RES配制成含RES1 MIC的培養(yǎng)液,37℃搖床震蕩孵育,在0h、2h、4h、6h、7h、8h分別檢測(cè)培養(yǎng)

7、菌液在OD630的變化,不含RES的培養(yǎng)液作對(duì)照。
  3金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株超微結(jié)構(gòu)變化:采用含藥平板接種法制備電鏡標(biāo)本,含藥平板的最終藥物濃度為0.256 mg/ml,接種金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株,37℃孵育18~24小時(shí),按照常規(guī)方法制備掃描和透射顯微鏡樣品。通過透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株超微結(jié)構(gòu)的影響。
  結(jié)果:
  1 RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC為0.256 mg/ml;含DMSO組的生長曲線與不

8、含RES的生長曲線基本一致,排除了DMSO對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的影響,在RES濃度為1/4 MIC和1/2 MIC時(shí),金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株生長受抑,生長曲線不典型,對(duì)數(shù)生長期變緩;RES濃度為1 MIC和2MIC時(shí)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株生長完全受抑制,生長曲線趨于平坦,說明金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株生長受到抑制(Fig.1)。
  2 RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株菌體細(xì)胞膜透性影響
  2.1 RES作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后培養(yǎng)液上清的電導(dǎo)率改變(Table1和Fig.2)含

9、1 MIC的RES培養(yǎng)液作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后,培養(yǎng)液上清的電導(dǎo)率在0h、2h、4h、6h、7h、8h時(shí)間點(diǎn)分別為1.13 ms/cm,1.40 ms/cm,1.51 ms/cm,1.73 ms/cm,1.77 ms/cm,1.74 ms/cm;含2 MIC的RES的培養(yǎng)液作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后,上清液電導(dǎo)率分別為:1.16 ms/cm,1.45 ms/cm,1.58 ms/cm,1.87 ms/cm,1.93 ms/cm,1.97 ms/cm

10、,對(duì)照組培養(yǎng)液上清電導(dǎo)率分別為1.13 ms/cm,1.23 ms/cm,1.28 ms/cm、1.29 ms/cm,1.33 ms/cm,1.23 ms/cm,數(shù)據(jù)采用軟件Spss13.0進(jìn)行重復(fù)性方差分析,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有顯著性差異,證明了RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)胞膜通透性有影響,造成菌體內(nèi)電解質(zhì)的大量外泄,導(dǎo)致菌體外培養(yǎng)液的電解質(zhì)濃度明顯高于未被藥物作用的培養(yǎng)液,尤其是對(duì)數(shù)生長期后,電導(dǎo)率改變更加明顯。
  2.21 M I

11、C的RES作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后培養(yǎng)液在260nm處吸光度的改變(Table2和Fig.3)檢測(cè)含1 MIC RES培養(yǎng)液作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后在0h、2h、4h、6h、7h、8h時(shí)間點(diǎn)的吸光度值,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液的OD260分別為:0.832、1.106、1.138、1.117、1.989,2.769;對(duì)照組培養(yǎng)液OD260分別為0.802、0.884、0.850、0.812、1.544、1.893,實(shí)驗(yàn)組OD260明顯高于對(duì)照組(P<0.05)

12、。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液在OD280數(shù)據(jù)分別是(Table3和Fig.4):0.811、1.093、1.122、1.136、1.766、2.629;對(duì)照組培養(yǎng)菌液OD280分別是0.601、0.609、1.078、1.235、1.493、2.180。實(shí)驗(yàn)組OD260和OD280明顯高于對(duì)照組(Spss13.0進(jìn)行重復(fù)性方差分析,P<0.05),進(jìn)一步說明RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)胞膜通透性有影響,導(dǎo)致大分子核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)由菌體內(nèi)外泄至培養(yǎng)液。

13、r>  2.3含RES培養(yǎng)液作用金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后在630nm處吸光度改變(Table4和Fig.5)含1 MIC的RES的LB肉湯培養(yǎng)接種金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株后,培養(yǎng)液在0h、2h、4h、6h、8h時(shí)OD630的吸光度分別是0.137,0.310,1.149,1.726,1.991,2.270,對(duì)照組分別是0.137,0.303,0.385,0.437,0.447,0.423,將數(shù)據(jù)繪制曲線,對(duì)照組曲線為正常細(xì)菌典型生長曲線,經(jīng)過緩沖期、對(duì)數(shù)增長

14、期和平臺(tái)期,實(shí)驗(yàn)組曲線一直處于平緩狀態(tài)。經(jīng)Spss13.0進(jìn)行重復(fù)性方差分析,實(shí)驗(yàn)組OD630和對(duì)照組OD630有顯著性差異,P<0.05。證實(shí)了1 MIC的RES完全抑制了金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的生長。3透射電鏡觀察顯示,RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株作用后,與對(duì)照組(Fig.6)相比,金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株菌體細(xì)胞形態(tài)變形嚴(yán)重,菌體大小不一,菌體邊界粗糙不圓潤,細(xì)胞壁缺損并有破裂,邊緣疏松不光滑,細(xì)胞膜變薄,菌體內(nèi)結(jié)構(gòu)松散,胞漿內(nèi)基質(zhì)深淺不一,核膜斷裂,細(xì)胞器結(jié)

15、構(gòu)模糊,細(xì)胞漿內(nèi)含物稀薄,局部呈現(xiàn)空泡化特征,菌體細(xì)胞形態(tài)超微結(jié)構(gòu)有明顯破壞和抑制作用。掃描電鏡觀察RES處理過的細(xì)菌大小不一,細(xì)胞分裂受阻,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞表面出現(xiàn)皺褶,周圍多棘狀突起(Fig.7)。
  結(jié)論:本研究證實(shí)了RES對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑制作用的機(jī)制是通過破壞金葡菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或功能,導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的改變,使細(xì)胞內(nèi)容物如各類無機(jī)鹽離子、大分子核酸、大分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)由菌體內(nèi)外泄至培養(yǎng)液,菌體內(nèi)外物質(zhì)的失衡,導(dǎo)致細(xì)菌菌體

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