表皮葡萄球菌色氨酰tRNA合成酶和ArlRS雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)作為抗菌靶標的研究.pdf

1、凝固酶陰性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)為人體皮膚表面常見的共生菌，通常不致病。但近年來隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌，主要原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm，BF)樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠更好地保護細菌抵抗抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊，并從中不斷釋放細菌，從而造成機體的反復感染，最終不得不將被污染的植入性醫(yī)療材料通過外科手術摘除，對

2、患者造成極大的痛苦和對社會造成巨大的經(jīng)濟損失。此外，由于抗生素的大量使用導致表皮葡萄球菌多重耐藥株(multi-drug resistant strains)的發(fā)生率日趨增高，急需開發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的藥物，尤其是能有效殺傷生物膜包被細菌的抗生素。
　　 本課題的目的是發(fā)現(xiàn)抗表皮葡萄球菌的藥靶，為開發(fā)新型抗葡萄球菌感染的藥物奠定理論和實踐基礎，主要采用兩種策略：一種策略是通過生物信息學的方法尋找細菌必須蛋白質(zhì)，通過同源模建和

3、虛擬篩選技術獲得針對該蛋白的潛在的小分子抑制劑，結(jié)合分子生物學和微生物學的方法對小分子化合物的抑酶和抗菌活性進行驗證；另一種策略是通過傳統(tǒng)的微生物遺傳學和分子生物學方法深入研究表皮葡萄球菌臨床菌株生物膜形成的相關分子機制，發(fā)現(xiàn)潛在藥物靶標，以期設計出針對生物膜的新型藥物。
　　 本論文分兩部分：第一部分通過生物信息學方法分析了表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶作為抗菌靶標的可行性，通過蛋白結(jié)構(gòu)同源模建和高通量虛擬篩選技術獲得潛在

4、的小分子抑制劑并對其生物學活性進行研究，在體外驗證了其抗菌活性；第二部分探討了表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)ArlRS對生物膜形成的調(diào)控作用，對其分子機制進行了較深入的研究，認為ArlRS可以作為抗生物膜的藥靶而發(fā)展出抗生物膜藥物。
　　 第一部分表皮葡萄球菌色氨酰tRNA合成酶作為抗菌靶標的研究
　　 氨酰tRNA合成酶(ARS)是一類古老而保守、廣泛存在于動物、植物、細菌、病毒等各種生物體中的酶。其功能是催化特定氨基

5、酸與相應tRNA之間的連接反應，以及水解錯誤的連接并加以校正，從而保證核酸、蛋白質(zhì)之間信息傳遞的準確性。由于氨酰tRNA合成酶是生物體中不能或缺的組成成分，而在真核生物和原核生物中又存在很大差異，使得在細菌多重抗藥性普遍越來越強、開發(fā)新藥的需求越來越迫切的今天，人們把目光投向了這類極具潛力的藥靶上來。色氨酰-tRNA合成酶(WRS)屬于氨酰tRNA合成酶Ⅰ類家族。目前針對WRS的有效抑制劑僅有吲哚霉素及其衍生物，但都未能進入臨床實驗。我

6、們運用生物信息學方法確認在表皮葡萄球菌全基因組中僅存在一個WRS的編碼基因trpS。通過對表皮葡萄球菌色氨酰-tRNA合成酶(SeWRS)的空間結(jié)構(gòu)進行同源模建，并在此基礎上運用高通量虛擬篩選技術共發(fā)現(xiàn)111個潛在的小分子抑制劑(先導化合物)，其中有三個化合物(Compound1-3)能明顯抑制靶蛋白的酶活性(半數(shù)抑制率濃度IC50范圍在15.1～42.2μM)，證實這3個化合物為SeWRS的抑制劑；而對人色氨酰-tRNA合成酶(HWR

7、S)活性的影響很弱(IC50范圍在89.3～>100μM)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)這3個化合物能在體外與靶蛋白SeWRS相結(jié)合(結(jié)合平衡常數(shù)Kd范圍在3.76～13.9μM)。體外抑菌實驗表明其中3個SeWRS抑制劑能明顯抑制表皮葡萄球菌的生長(MIC范圍在6.25～100μM)，其中Compound1和Compound2能明顯抑制金黃色葡萄球菌的生長；而上述3個SeWRS抑制劑在實驗中的最高濃度(200μM)下對大腸桿菌的生長均無抑制作用。

8、此外，這3個SeWRS抑制劑對哺乳動物細胞(Vero細胞)無明顯細胞毒性，提示了這些化合物作為新型抗葡萄球菌感染藥物的開發(fā)前景。
　　 第二部分表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)ArlRS在生物膜形成中的作用：作為抗生物膜藥靶的可行性研究
　　 表皮葡萄球菌能夠形成生物膜(Biofilm)，該結(jié)構(gòu)是其抵抗抗生素治療和宿主免疫系統(tǒng)的攻擊、以及導致感染遷延不愈的主要原因，因此研發(fā)抗生物膜的藥物也是對抗表皮葡萄球菌感染的策略之一。

9、
　　 表皮葡萄球菌生物膜的形成及其調(diào)控是非常復雜的過程。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為兩個階段：單個細菌初始黏附到材料表面；細菌之間互相黏附，形成多細胞層的結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個階段的一些功能基因(如atlE、icaADBC、aap、bap等)，其中icaADBC編碼細胞間多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesion，PIA)，而PIA是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分之一，但在表

10、皮葡萄球菌臨床分離株中也發(fā)現(xiàn)部分菌株的基因組中雖然存在icaADBC基因，但不形成生物膜(即ica+/BF-菌株)。很多調(diào)控因子(如sarA、sigB、agr等)在生物膜形成的兩個階段對上述功能性基因的表達起調(diào)控作用。目前，國外文獻和本實驗室的相關研究均提示雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(Two-component Signal Transduction Systems，TCSs)參與了生物膜形成的調(diào)控。本實驗室前期研究在表皮葡萄球菌基因組中發(fā)現(xiàn)了

11、16對TCSs，本論文主要探討了其中的ArlRS對生物膜形成的調(diào)控機制，以期從中發(fā)現(xiàn)新的抗生物膜的靶點。
　　 首先使用溫度敏感性穿梭質(zhì)粒pBT2，采用同源重組法在表皮葡萄球菌1457株基因組中刪除了雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)ArlRS的組氨酸激酶編碼基因arlS，獲得了arlS基因刪除株(WW06株)；通過PCR、RT-PCR確認arlS基因刪除株構(gòu)建成功，并采用梅里埃公司API-Staph細菌鑒定系統(tǒng)確認WW06為表皮葡萄球菌。We

12、stern Blot結(jié)果表明WW06株不表達ArlR蛋白，因此WW06株是ArlRS系統(tǒng)缺失株。WW06株的生長曲線與野生株相似，但不形成生物膜。對WW06株喪失生物膜形成能力的機制進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)其初始黏附能力并未發(fā)生變化，而通過基因芯片以及Real-Time RT-PCR等方法，發(fā)現(xiàn)參與生物膜形成第二階段的一些基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，如icaADBC轉(zhuǎn)錄水平降低5-10倍、sigB轉(zhuǎn)錄水平降低約10倍、sarA轉(zhuǎn)錄水平

13、降低約3-5倍。凝膠遷移阻滯實驗(EMSA)證明ArlR可以與icaADBC的啟動子區(qū)特異性結(jié)合，提示ArlRS對icaADBC的轉(zhuǎn)錄起到直接調(diào)控作用。在WW06株中過表達icaADBC可以恢復形成生物膜的表型，而過表達sigB則不能恢復，上述結(jié)果證明icaADBC是ArlRS調(diào)節(jié)的下游功能基因，ArlRS通過直接調(diào)節(jié)icaADBC的轉(zhuǎn)錄對生物膜的形成起正調(diào)控作用。進一步檢測9株ica+/BF-的表皮葡萄球菌在對數(shù)生長中期(4hrs)的

14、icaADBC轉(zhuǎn)錄水平和arlRS的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示與SE1457相比，icaADBC和arlRS的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，提示兩者之間存在相關性。實驗結(jié)果表明ArlRS可作為潛在的抗生物膜靶標。
　　 本論文采用兩種策略，一方面通過生物信息學、結(jié)構(gòu)生物學和細菌分子生物學等方法獲得了具有抑菌活性的表皮葡萄球菌色氨酰tRNA合成酶抑制劑；另一方面通過細菌遺傳學和分子生物學等方法深入研究了表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)ArlRS對生物