MicroRNAs對細胞信號轉導調(diào)控的研究.pdf

1、隨著人類生活水平和生存環(huán)境的改變，代謝與內(nèi)分泌疾病的發(fā)病率逐年上升。糖尿病是其中最常見的一種慢性疾病，其主要特征是血糖代謝的紊亂，分為Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病，臨床上95％以上患者為Ⅱ型糖尿?。═2DM）。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病發(fā)病的主要原因是胰島素抵抗，其貫穿于Ⅱ型糖尿病的整個過程。雖然多項研究結果提示胰島素抵抗與激素因子、炎癥反應及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等共同作用有關，但關于胰島素抵抗的具體機制尚不明確。MicroRNAs(miRNAs)是一大類進

2、化保守的小分子非編碼RNAs，典型的miRNAs由20-25個單核苷酸組成，miRNAs可通過序列特異性的方式與特定靶基因的3’端非編碼區(qū)（3’UTR）相互作用來調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達，從而發(fā)揮其生物學功能。許多miRNA與Ⅱ型糖尿病的發(fā)展有著密切的關系。Zampetaki等監(jiān)測到，健康人且后來發(fā)生糖尿病的那些患者其血漿中有多種miRNAs的水平逐漸發(fā)生變化，如microRNA-126(miR-126)在糖尿病人血漿中的含量明顯減少。因此

3、,我們認為miR-126與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展可能有密切關系。鑒于目前miR-126與Ⅱ型糖尿病發(fā)病機制尚不明確，本課題在INS-1細胞（大鼠胰島β細胞株）應用miRNA的過/低表達及功能研究等方法，探討了miR-126對胰島素信號通路的調(diào)控作用及機制。
　　目的：
　　本課題旨在研究miR-126對INS-1細胞胰島素信號通路的調(diào)控作用及機制，為Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展提供新的理論基礎及潛在的治療靶點。
　　方法：<

4、br>　　生物信息學方法預測miR-126的潛在靶基因。以培養(yǎng)的INS-1細胞為模型，將人工合成的miR-126模擬物進行轉染，并用實時熒光定量PCR方法及熒光顯微鏡檢測轉染效率。轉染48小時后的INS-1細胞用人工合成胰島素（100nM）刺激12小時，提取細胞總蛋白進行BCA蛋白定量。利用WesternBlot方法檢測miR-126對預測靶基因蛋白表達的影響；利用MTT法檢測miR-126對INS-1細胞增殖的影響。
　　結果：

5、
　　通過生物信息學檢索PicTar、BibiServ等軟件發(fā)現(xiàn)：在胰島素受體底物-1（IRS-1）及PIK3R2mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）存在miR-126的潛在結合位點，二者與miR-126結合自由能分別為?19.3和?19.4kcal/mol，提示miR-126可能調(diào)控IRS-1及PIK3R2mRNA的表達。為了干預內(nèi)源性miRNA的表達，我們將人工合成miR-126模擬物轉染INS-1細胞48小時，定量PCR結果

6、顯示：人工合成的miRNA模擬物在體外可有效調(diào)節(jié)內(nèi)源性miRNA的表達。為進一步證明IRS-1和PIK3R2是miR-126的靶點，我們將INS-1細胞分別轉染miR-126mimics、miR-126mutation、miRNAcontrolmimics或Si-IRS148小時后用100nM胰島素刺激12小時，Westernblot結果顯示：轉染miR-126mimics以及Si-IRS1組IRS-1、PIK3R2及Akt蛋白表達明顯

7、下調(diào)。另外，我們用100nM胰島素不同時間段（0分鐘、1分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘）刺激INS-1細胞，用Westernblot方法檢測Akt蛋白磷酸化水平，結果顯示：胰島素可時間依賴性促進INS-1細胞Akt磷酸化效應，而Akt蛋白表達無明顯變化。另外，為進一步探討miR-126與INS-1細胞功能的關系，我們將INS-1細胞分別轉染miR-126mimics、miRNAcontrolmimics（CTm）或Si-IR

8、S148小時后用100nM胰島素刺激12小時，利用MTT法檢測INS-1細胞的增殖情況，結果顯示：與對照組相比，過表達miR-126組INS-1細胞的增殖明顯受到抑制，其抑制率達30.05%。
　　結論：
　　IRS-1和PIK3R2mRNA是miR-126的靶點，miR-126通過作用于IRS-1及PIK3R2基因3’端非編碼區(qū)上特異性靶序列抑制INS-1細胞IRS-1、PIK3R2及下游Akt蛋白的表達；胰島素可時間依賴

9、性促進INS-1細胞Akt磷酸化效應；miR-126可能以IRS-1及PIK3R2為靶點抑制IRS-1/PI3K/Akt信號通路，從而抑制INS-1細胞的增殖。
　　2;炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化的各個階段。其初期特征是白細胞的聚集和內(nèi)皮細胞（ECs）的激活。MicroRNAs(miRNAs)是一大類進化保守的小分子非編碼RNAs，典型的miRNA由20-25個單核苷酸組成，miRNAs可通過序列特異性的方式與特定靶基因的3’端非

10、編碼區(qū)（3’UTR）相互作用來調(diào)節(jié)基因表達，然而miRNAs與內(nèi)皮功能的關聯(lián)尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-221/222在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）以及血管平滑肌細胞（VSMCs）高度表達。Ets-1是與炎癥及血管腔形成聯(lián)系密切的一種重要轉錄因子，通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)：ETS-1mRNA的3’非翻譯區(qū)存在miR-155和miR-221/222的潛在結合位點；Westernblot實驗也證明：在HUVECs

11、中miR-155和miR-221以ETS-1為靶點發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用；另外，血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）也是miR-155的靶點。定量PCR結果顯示：HUVECs中血管緊張素Ⅱ（AngII）刺激Ets-1及其下游基因（包括VCAM1,MCP1andFLT1）表達上調(diào)，這種作用可部分被miR-155及miR-221/222的過表達逆轉；miR-155以AT1R為靶點，可減少AngII引起的HUVECs細胞遷移?？傊?，我們的研究發(fā)現(xiàn)