MicroRNAs對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的研究.pdf

1、隨著人類(lèi)生活水平和生存環(huán)境的改變，代謝與內(nèi)分泌疾病的發(fā)病率逐年上升。糖尿病是其中最常見(jiàn)的一種慢性疾病，其主要特征是血糖代謝的紊亂，分為Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病，臨床上95％以上患者為Ⅱ型糖尿?。═2DM）。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病發(fā)病的主要原因是胰島素抵抗，其貫穿于Ⅱ型糖尿病的整個(gè)過(guò)程。雖然多項(xiàng)研究結(jié)果提示胰島素抵抗與激素因子、炎癥反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等共同作用有關(guān)，但關(guān)于胰島素抵抗的具體機(jī)制尚不明確。MicroRNAs(miRNAs)是一大類(lèi)進(jìn)

2、化保守的小分子非編碼RNAs，典型的miRNAs由20-25個(gè)單核苷酸組成，miRNAs可通過(guò)序列特異性的方式與特定靶基因的3’端非編碼區(qū)（3’UTR）相互作用來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。許多miRNA與Ⅱ型糖尿病的發(fā)展有著密切的關(guān)系。Zampetaki等監(jiān)測(cè)到，健康人且后來(lái)發(fā)生糖尿病的那些患者其血漿中有多種miRNAs的水平逐漸發(fā)生變化，如microRNA-126(miR-126)在糖尿病人血漿中的含量明顯減少。因此

3、,我們認(rèn)為miR-126與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展可能有密切關(guān)系。鑒于目前miR-126與Ⅱ型糖尿病發(fā)病機(jī)制尚不明確，本課題在INS-1細(xì)胞（大鼠胰島β細(xì)胞株）應(yīng)用miRNA的過(guò)/低表達(dá)及功能研究等方法，探討了miR-126對(duì)胰島素信號(hào)通路的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　目的：
　　本課題旨在研究miR-126對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的調(diào)控作用及機(jī)制，為Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)及潛在的治療靶點(diǎn)。
　　方法：<

4、br>　　生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-126的潛在靶基因。以培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞為模型，將人工合成的miR-126模擬物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法及熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的INS-1細(xì)胞用人工合成胰島素（100nM）刺激12小時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量。利用WesternBlot方法檢測(cè)miR-126對(duì)預(yù)測(cè)靶基因蛋白表達(dá)的影響；利用MTT法檢測(cè)miR-126對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：

5、
　　通過(guò)生物信息學(xué)檢索PicTar、BibiServ等軟件發(fā)現(xiàn)：在胰島素受體底物-1（IRS-1）及PIK3R2mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）存在miR-126的潛在結(jié)合位點(diǎn)，二者與miR-126結(jié)合自由能分別為?19.3和?19.4kcal/mol，提示miR-126可能調(diào)控IRS-1及PIK3R2mRNA的表達(dá)。為了干預(yù)內(nèi)源性miRNA的表達(dá)，我們將人工合成miR-126模擬物轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞48小時(shí)，定量PCR結(jié)果

6、顯示：人工合成的miRNA模擬物在體外可有效調(diào)節(jié)內(nèi)源性miRNA的表達(dá)。為進(jìn)一步證明IRS-1和PIK3R2是miR-126的靶點(diǎn)，我們將INS-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-126mimics、miR-126mutation、miRNAcontrolmimics或Si-IRS148小時(shí)后用100nM胰島素刺激12小時(shí)，Westernblot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-126mimics以及Si-IRS1組IRS-1、PIK3R2及Akt蛋白表達(dá)明顯

7、下調(diào)。另外，我們用100nM胰島素不同時(shí)間段（0分鐘、1分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘）刺激INS-1細(xì)胞，用Westernblot方法檢測(cè)Akt蛋白磷酸化水平，結(jié)果顯示：胰島素可時(shí)間依賴(lài)性促進(jìn)INS-1細(xì)胞Akt磷酸化效應(yīng)，而Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。另外，為進(jìn)一步探討miR-126與INS-1細(xì)胞功能的關(guān)系，我們將INS-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-126mimics、miRNAcontrolmimics（CTm）或Si-IR

8、S148小時(shí)后用100nM胰島素刺激12小時(shí)，利用MTT法檢測(cè)INS-1細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-126組INS-1細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，其抑制率達(dá)30.05%。
　　結(jié)論：
　　IRS-1和PIK3R2mRNA是miR-126的靶點(diǎn)，miR-126通過(guò)作用于IRS-1及PIK3R2基因3’端非編碼區(qū)上特異性靶序列抑制INS-1細(xì)胞IRS-1、PIK3R2及下游Akt蛋白的表達(dá)；胰島素可時(shí)間依賴(lài)

9、性促進(jìn)INS-1細(xì)胞Akt磷酸化效應(yīng)；miR-126可能以IRS-1及PIK3R2為靶點(diǎn)抑制IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制INS-1細(xì)胞的增殖。
　　2;炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段。其初期特征是白細(xì)胞的聚集和內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的激活。MicroRNAs(miRNAs)是一大類(lèi)進(jìn)化保守的小分子非編碼RNAs，典型的miRNA由20-25個(gè)單核苷酸組成，miRNAs可通過(guò)序列特異性的方式與特定靶基因的3’端非

10、編碼區(qū)（3’UTR）相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，然而miRNAs與內(nèi)皮功能的關(guān)聯(lián)尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-221/222在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）以及血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）高度表達(dá)。Ets-1是與炎癥及血管腔形成聯(lián)系密切的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)：ETS-1mRNA的3’非翻譯區(qū)存在miR-155和miR-221/222的潛在結(jié)合位點(diǎn)；Westernblot實(shí)驗(yàn)也證明：在HUVECs

11、中miR-155和miR-221以ETS-1為靶點(diǎn)發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)控作用；另外，血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）也是miR-155的靶點(diǎn)。定量PCR結(jié)果顯示：HUVECs中血管緊張素Ⅱ（AngII）刺激Ets-1及其下游基因（包括VCAM1,MCP1andFLT1）表達(dá)上調(diào)，這種作用可部分被miR-155及miR-221/222的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)；miR-155以AT1R為靶點(diǎn)，可減少AngII引起的HUVECs細(xì)胞遷移?？傊覀兊难芯堪l(fā)現(xiàn)