激活態(tài)雪旺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實驗研究.pdf

1、周圍神經(jīng)的缺損，尤其是長段周圍神經(jīng)的缺損的修復(fù)是外科領(lǐng)域的一大難題。隨著組織工程材料的不斷發(fā)展和對于組織工程神經(jīng)認(rèn)識的不斷深入，使得人工神經(jīng)的發(fā)展成為一個非常有前景的領(lǐng)域。膠元-幾丁糖有可能作為人工神經(jīng)支架的良好材料：激活態(tài)雪旺細(xì)胞是一種具有高活性、快速增殖的可以顯著促進周圍神經(jīng)再生的細(xì)胞，是組織工程人工神經(jīng)良好的種子細(xì)胞。本課題將要分三個部分研究為何激活態(tài)雪旺細(xì)胞有優(yōu)于正常態(tài)雪旺細(xì)胞的生物活性? 第一部分 激活態(tài)雪旺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)通路的分子構(gòu)成 目的 探索激活態(tài)雪旺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子構(gòu)成。方法 用改良成年SD大鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)激活態(tài)雪旺細(xì)胞(ASC)和正常態(tài)雪旺細(xì)胞(NSC)，分別用RTK和G蛋白耦聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的七個抑制劑，Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)的p-ERK1/2水平的改變，比較激活態(tài)雪旺細(xì)胞和正常態(tài)雪旺細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的差異。結(jié)果 光鏡下激活態(tài)雪旺細(xì)胞和正常態(tài)的雪旺細(xì)胞形態(tài)上無差異，S-100染色均為陽性，Western

3、 Bolt法檢測ASC和NSC細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2水平無明顯的差異，但ASC內(nèi)p-ERK1/2水平有顯著差異(p<0.01)。在激活態(tài)雪旺細(xì)胞，使用抑制劑CTX、D609和BAPTA-AM細(xì)胞內(nèi)的p-ERK1/2水平顯著降低，而其它抑制劑使用后細(xì)胞內(nèi)的p-ERK1/2水平無明顯的改變，差異具有顯著性(p<0.01)；在正常態(tài)的雪旺細(xì)胞，使用抑制劑U73122和BAPTA-AM，細(xì)胞內(nèi)的p-ERK1/2水平顯著降低，而其它抑制劑使用后細(xì)胞

4、內(nèi)的p-ERK1/2水平無明顯的改變，差異具有顯著性(p<0.01)。結(jié)論 激活態(tài)雪旺細(xì)胞和正常態(tài)雪旺細(xì)胞是同一細(xì)胞的二種不同存在的狀態(tài)，有活性的p-ERK1/2的水平的升高可能是雪旺細(xì)胞激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。激活態(tài)雪旺細(xì)胞和正常態(tài)雪旺細(xì)胞都是通過G蛋白耦聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮生物效應(yīng)的，但是激活態(tài)雪旺細(xì)胞通過PC-PLC分解磷脂酰膽堿使細(xì)胞內(nèi)的DAG水平的提高來發(fā)揮生物效應(yīng)的，而正常態(tài)雪旺細(xì)胞則通過PI-PLC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其生物效應(yīng)的

5、。 第二部分 應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子蛋白/DNA組合芯片技術(shù)檢測激活態(tài)雪旺細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)錄因子 目的 檢測激活態(tài)雪旺細(xì)胞活性轉(zhuǎn)錄因子。方法 應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子蛋白/DNA組合芯片技術(shù)檢測激活態(tài)雪旺細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果 激活態(tài)雪旺細(xì)胞和正常態(tài)雪旺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子芯片點陣圖顯示：激活態(tài)雪旺細(xì)胞比正常態(tài)雪旺細(xì)胞有5個轉(zhuǎn)錄因子蛋白上調(diào)2倍以上，它們是AP-1、NRF-1、NF-Atx、PO-B和PRDI-BF：活化的AP-1蛋白的顯著增加可能就

6、是激活態(tài)雪旺細(xì)胞增殖活性高重要的原因：NF-Atx表達升高可能是協(xié)同AP-1的轉(zhuǎn)錄表達；激活態(tài)雪旺細(xì)胞可能通過提高NRF1和mtTFA表達，引起線粒體呼吸鏈酶蛋白表達升高，線粒體酶活性升高，從而提高線粒體能量代謝，為激活態(tài)雪旺細(xì)胞的高分泌狀態(tài)提供能量，促進激活態(tài)雪旺細(xì)胞的增殖；而PO-G不僅作用于它的靶基因，而且還作用于其它的基因位點，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和DNA的修復(fù)和復(fù)制。PRDI-BF的升高也與激活態(tài)雪旺細(xì)胞的特殊的功能密切相關(guān)的。結(jié)論 5個

7、轉(zhuǎn)錄因子蛋白上調(diào)都與激活態(tài)雪旺細(xì)胞的快速分裂、高分泌狀態(tài)密切相關(guān)。 第三部分 應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測激活態(tài)雪旺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 目的 應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測激活態(tài)雪旺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法 采用熒火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶組成雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炏到y(tǒng)，構(gòu)建含NGF-TF與promotor/TRE的啟動子的載體，感染激活態(tài)雪旺細(xì)胞，雪旺細(xì)胞的處理則分為7組：1．激活態(tài)雪旺細(xì)胞空白對照：2．激活態(tài)雪

8、旺細(xì)胞+0.8μg pGL3+40 ng phRL-SV40；3．激活態(tài)雪旺細(xì)胞+0.8μg pGL3-NGFpromotor+40 ng phRL-SV40：4．激活態(tài)雪旺細(xì)胞+0.8 μg pGL3-NGFpromotor+40 ngphRL-SV40+加藥0.5小時；5．激活態(tài)雪旺細(xì)胞+0.8μg pGL3-NGFpromotor+40 ng phRL-SV40+加藥1小時：6．激活態(tài)雪旺細(xì)胞+0.8μg pGL3-NGFprom

9、otor+40 ng phRL-SV40+加藥1.5小時：7．激活態(tài)雪旺細(xì)胞+0.8μg pGL3-NGFpromotot+40 ng phRL-SV40+加藥2小時。結(jié)果 從第三組加入活化的NGF的啟動子但沒有加入抑制劑后，RLU1的數(shù)值含有激活態(tài)雪旺細(xì)胞自身的熒光、海腎熒光素酶的熒光強度和螢火蟲熒光素酶作用于底物的熒光強度的總和，因而數(shù)值最大，其相對值RLU1/RLU2也是最大，使用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑D609后，第四組在用藥0.5小時后