激活態(tài)雪旺細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、引言:組織工程為周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)提供了新的方法,填充了雪旺細(xì)胞的可吸收人工神經(jīng)導(dǎo)管有望在將來替代自體神經(jīng)移植應(yīng)用于臨床。通過“激活液”(專利申請(qǐng)中)外源性刺激獲得的激活態(tài)雪旺細(xì)胞,在增殖能力和分泌活性都明顯超過正常的雪旺細(xì)胞,而且促進(jìn)神經(jīng)再生的效果也明顯增強(qiáng)。體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的激活態(tài)雪旺細(xì)胞應(yīng)用于臨床的一個(gè)必要前提是安全可靠,無致癌性、致畸性。本研究的目的是聯(lián)合體內(nèi)、體外多個(gè)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)激活態(tài)雪旺細(xì)胞是否安全,有無應(yīng)用于臨床的可能。本研究

2、共分為4個(gè)部分:
　　第一部分，培養(yǎng)成年大鼠雪旺細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)的比較研究
　　目的:通過橫向比較,探索適合臨床應(yīng)用的成年雪旺細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。
　　方法:成年SD大鼠,分4組,每組10只,從雙側(cè)坐骨神經(jīng)取材培養(yǎng)雪旺細(xì)胞。A組采用體內(nèi)預(yù)變性法+快速酶消化法;B組采用體內(nèi)預(yù)變性法+慢速酶消化法;C組采用體外預(yù)變性法+快速酶消化法;D組采用體外預(yù)變性法+慢速酶消化法。細(xì)胞傳代使用冷噴射傳代法和胰酶消化傳代法。比較(1)體內(nèi)、體外

3、預(yù)變性增加取材神經(jīng)中雪旺細(xì)胞的數(shù)目有無差別;(2)快速、慢速酶消化法從神經(jīng)中獲取雪旺細(xì)胞的效率;(3)冷噴射傳代法和胰酶消化傳代法的效率。篩選使動(dòng)物痛苦小、而雪旺細(xì)胞數(shù)量多、純度高等最適合臨床應(yīng)用的方法。
　　結(jié)果:體外預(yù)變性和體內(nèi)預(yù)變性都能明顯增加取材神經(jīng)中的雪旺細(xì)胞數(shù)目,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但體外預(yù)變性減輕了患者的痛苦?？焖倜赶ê吐倜赶ㄔ谂囵B(yǎng)1周時(shí)獲得的雪旺細(xì)胞數(shù)目相似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。冷噴射傳代法兼有純化雪旺細(xì)胞的作用,會(huì)

4、損失一定數(shù)量的雪旺細(xì)胞,對(duì)操作者技術(shù)要求高;胰酶消化傳代法沒有純化的作用,對(duì)操作者技術(shù)要求低。
　　結(jié)論:體外預(yù)變性減輕患者痛苦,更適合臨床應(yīng)用;快速、慢速酶消化法效果無明顯差異,均可考慮應(yīng)用;冷噴射傳代法可以和胰酶消化傳代法有機(jī)結(jié)合使用,前者在雪旺細(xì)胞純度較低時(shí)應(yīng)用,后者在雪旺細(xì)胞純度較高時(shí)應(yīng)用。
　　第二部分，激活態(tài)雪旺細(xì)胞體外生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:體外檢測(cè)激活態(tài)雪旺細(xì)胞的生物學(xué)特性,與良性、惡性細(xì)胞對(duì)比

5、,分析其是否有惡性細(xì)胞的特點(diǎn)。
　　方法:從成年大鼠坐骨神經(jīng)中分離并體外培養(yǎng)激活態(tài)雪旺細(xì)胞,通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)的連續(xù)觀察、生長(zhǎng)方式的變化、免疫學(xué)標(biāo)志物鑒定、增殖率和純度檢測(cè)、遷移能力和侵襲能力檢測(cè)、染色體核型分析,及全基因組表達(dá)譜基因芯片、細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè),對(duì)激活態(tài)雪旺細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行綜合評(píng)估。
　　結(jié)果:激活態(tài)雪旺細(xì)胞在體外培養(yǎng)形態(tài)均一、無異質(zhì)性變化。增殖能力增加,受密度抑制影響減小。連續(xù)傳代不丟失S100、P75LN

6、GFR、GFAP等免疫學(xué)標(biāo)識(shí)物,遷移能力、侵襲能力略有增加,但明顯弱于惡性細(xì)胞。染色體仍為2倍體?；蚝偷鞍妆磉_(dá)存在動(dòng)態(tài)平衡,第2、3代總體表達(dá)最高。
　　結(jié)論:從成年大鼠周圍神經(jīng)分離并體外培養(yǎng)獲得的激活態(tài)雪旺細(xì)胞,基本不具備惡性細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　第三部分，激活態(tài)雪旺細(xì)胞自體移植后的體內(nèi)過程
　　目的:模擬臨床應(yīng)用,探索激活態(tài)雪旺細(xì)胞的體內(nèi)變化過程,是否會(huì)形成腫瘤。
　　方法:從成年大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)培養(yǎng)足量

7、的激活態(tài)雪旺細(xì)胞,移植到自體腋窩下,與良性、惡性細(xì)胞移植對(duì)比。50只成年大鼠分三組:A組:激活態(tài)雪旺細(xì)胞,自體移植細(xì)胞數(shù)目1×107個(gè),大鼠20只;B:正常雪旺細(xì)胞,自體移植細(xì)胞數(shù)目1×107個(gè),大鼠20只;C組,惡性大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞,移植細(xì)胞數(shù)目2×106個(gè),大鼠10只。分別在移植細(xì)胞后0.5個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月對(duì)大鼠腋窩注射細(xì)胞處取材,觀察大體標(biāo)本上是否有細(xì)胞團(tuán)或腫瘤形成,解剖局部及內(nèi)臟觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成。將

8、局部的細(xì)胞團(tuán)塊或腫瘤做免疫組織化學(xué)鑒定,并查找病理性核分裂相。
　　結(jié)果:注射惡性細(xì)胞的大鼠(C組),均在0.5～1個(gè)月長(zhǎng)出腫瘤。而激活態(tài)雪旺細(xì)胞組(A組)和正常雪旺細(xì)胞組(B組)在體內(nèi)不形成腫瘤,體內(nèi)的過程相似,至少可以在腋窩下存活2個(gè)月,并表達(dá)免疫學(xué)標(biāo)志物。
　　結(jié)論:激活態(tài)雪旺細(xì)胞在體內(nèi)非正常微環(huán)境下至少可以存活2個(gè)月,并表達(dá)免疫學(xué)標(biāo)志物,不形成腫瘤。
　　第四部分，激活態(tài)雪旺細(xì)胞自體移植對(duì)后代影響的實(shí)驗(yàn)研究

9、r>　　目的:探索激活態(tài)雪旺細(xì)胞自體移植是否對(duì)后代產(chǎn)生影響。
　　方法:從成年雌性動(dòng)物坐骨神經(jīng)培養(yǎng)出足量的激活態(tài)雪旺細(xì)胞后自體移植,然后與雄性大鼠同籠喂養(yǎng)3個(gè)月。與單純坐骨神經(jīng)切除的動(dòng)物對(duì)比后代的生物學(xué)性狀,如懷孕率,新生鼠的活胎數(shù)、死胎數(shù)、體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)的比較,染色體數(shù)目的檢測(cè)。新生鼠4周時(shí)的發(fā)育、基本行為能力、對(duì)傷害的認(rèn)知等。結(jié)果:無論是否移植激活態(tài)雪旺細(xì)胞,單側(cè)坐骨神經(jīng)切除后的成年雌性大鼠,3個(gè)月內(nèi)懷孕率均為40％。實(shí)驗(yàn)組