hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的:雪旺細(xì)胞作為周圍神經(jīng)工程中的核心種子細(xì)胞，在神經(jīng)修復(fù)。再生等方面發(fā)揮重要作用，而體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，常因多次連續(xù)傳代后衰老而凋亡，最終死亡。永生化雪旺細(xì)胞具有無限傳代的功能，可解決雪旺細(xì)胞在組織工程中應(yīng)用的難題。本實驗通過hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞以期得到永生化細(xì)胞。
　　 方法:1.選取出生后7天左右的SD大鼠，冰凍處死后酒精浸泡消毒，取其坐骨神經(jīng)以及臂叢神經(jīng)，剪碎至1mm3大小的組織塊，雙酶消化法進行體外分離培養(yǎng)，

2、待細(xì)胞生長到85％匯合密度時用低濃度胰酶快速消化傳代，30分鐘差速貼壁法進一步純化雪旺細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。經(jīng)S100免疫熒光鑒是否為雪旺細(xì)胞。2.將純化的雪旺細(xì)胞用含hTERT基因的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染原代雪旺細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長滿80％密度時更換含G418(100ug/ml)的完全培養(yǎng)基，每3天換液1次，篩選2周，轉(zhuǎn)入含hTERT基因的質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)過篩選獲得陽性克隆后繼續(xù)

3、傳代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞經(jīng)S-100蛋白免疫熒光鑒定。3.轉(zhuǎn)染成功后的雪旺細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)染后第5、10、20、30代雪旺細(xì)胞與原代雪旺細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5代的雪旺細(xì)胞進行實驗，應(yīng)用熒光定量PCR和免疫印跡Westernbloting法分別檢測雪旺細(xì)中NGF、BDNF和BFGF的表達情況。
　　 結(jié)果:1.經(jīng)雙酶消化法可以獲得大量處于增殖狀態(tài)的雪旺細(xì)胞，應(yīng)用差速貼壁傳代法后可以獲得典型的長梭形放射狀肩并肩排列的雪旺細(xì)胞，光鏡視

4、野下雪旺細(xì)胞純度可以達到90％以上，成纖維細(xì)胞量少，經(jīng)S-100蛋白免疫熒光測定鑒定為雪旺細(xì)胞。2hTERT基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后光學(xué)顯微鏡觀察可見轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞胞體體積大，呈長梭形，無規(guī)則貼壁生長，熒光顯微鏡下觀察見未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無熒光，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞為綠色熒光。經(jīng)S100免疫熒光鑒定為雪旺細(xì)胞。3.通過熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)，原代雪旺細(xì)胞中NGFmRNA的表達較培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞明顯增加，hTERT基因轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞中NGFmRNA的

5、表達呈現(xiàn)穩(wěn)定性，并且隨著傳代次數(shù)的增加，其表達逐漸降低。BDNF和BFGFmRNA表達也具有相同的情況，培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞中BDNF和BFGFmRNA表達明顯降低，而轉(zhuǎn)染初期（轉(zhuǎn)染后5、10代）其表達能力維持在穩(wěn)定水平，但隨著傳代次數(shù)的增加，其表達能力逐漸下降。上述結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。4.WesternBloting結(jié)果分析顯示，培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞中NGF蛋白表達較原代雪旺細(xì)胞明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)

6、染后的雪旺細(xì)胞NGF蛋白表達與原代雪旺細(xì)胞大致相同，且均高于培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞，可見NGF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后早期（轉(zhuǎn)染后5、10代）與晚期（轉(zhuǎn)染后20、30代）均能穩(wěn)定表達，無明顯差異(P＞0.05)。BDNF和BFGF蛋白表達情況基本一致，原代雪旺細(xì)胞與轉(zhuǎn)染早期（轉(zhuǎn)染后5、10代）的雪旺細(xì)胞中兩個蛋白的表達情況基本相同，并且均高于培養(yǎng)5代的雪旺細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后晚期（轉(zhuǎn)染后20、30代）的雪旺細(xì)胞，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。