VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)采用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，構(gòu)建VEGF真核表達(dá)質(zhì)粒，利用陽離子脂質(zhì)體將其攜帶導(dǎo)入MSCs中，檢測外源質(zhì)粒在MSCs中的表達(dá)，旨在通過基因轉(zhuǎn)染這一途徑將VEGF與MSCs結(jié)合起來，從而為探索一種更加有效的缺血性心臟病治療方法提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。　　方法：將SD大鼠處死，分離四肢長骨，運(yùn)用直接法分離出其中的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、鑒定，傳代細(xì)胞分別進(jìn)入試驗(yàn)組和對照組。制備SD大鼠急性心梗模型，24小時后，取心

2、臟提取總mRNA，設(shè)計大鼠VEGF引物，利用RT-PCR的方法擴(kuò)增VEGF基因片斷。轉(zhuǎn)化感受肽，連接T載體，進(jìn)行測序驗(yàn)證后，將VEGF基因連接于PcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Top10感受肽，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。試驗(yàn)組用構(gòu)建好的PcDNA3.1-VEGF進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，陽性對照組用PcDNA3.1空質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，陰性對照組只加入培養(yǎng)液。用pEGFP綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染MSCs以分析瞬時轉(zhuǎn)染效率；收集各組第1、3、5、7、9、11天的上清液，用大鼠VEG

3、F的ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中VEGF的濃度，各組進(jìn)行比較，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；轉(zhuǎn)染細(xì)胞用G418進(jìn)行篩選，兩周后形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的菌落，將其進(jìn)行擴(kuò)增，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Westernblot分析；同時，用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后VEGF的表達(dá)對MSCs增殖的影響。　　結(jié)論：直接法是一種有效、方便、快捷的MSCs分離方法。我們所分離的細(xì)胞能傳十代以上，具有干細(xì)胞特性以及MSCs的特異性標(biāo)志陽性，而不表達(dá)造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志。陽離子脂