人β-NGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建、并觀察攜帶人-β-NGF(nervegrowthfactor,神經(jīng)生長因子)重組質(zhì)粒的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromalstem cell,BMSC)的生物學(xué)特性,為應(yīng)用β-NGF修飾的BMSC進(jìn)行耳蝸移植治療老年聾的動物實(shí)驗(yàn)研究提供支持。
　　方法：將含有重組質(zhì)粒的陽性克隆大腸桿菌接種至37℃預(yù)溫的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)24小時進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)增,取擴(kuò)增好的菌夜按質(zhì)粒提取試劑盒說明提取重組質(zhì)粒,提

2、取成功后對其進(jìn)行HindIII、XhoI雙酶切鑒定,-20℃保存?zhèn)溆?。?fù)蘇小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞學(xué)鑒定其表面CD標(biāo)記,然后將GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分為四組:A組為脂質(zhì)體2000包裹的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;B組為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組;C組為脂質(zhì)體包裹的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;D組為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的陰性對照組。采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法將含有人β-NGF神經(jīng)生長因子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至含有GFP基

3、因的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中,在倒置光學(xué)顯微鏡下對比各組細(xì)胞的數(shù)量及觀察細(xì)胞突起的生長情況,收集各組細(xì)胞的上清液,分別利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的方法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中人-β-NGF基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切后,限制性內(nèi)酶切片段長度與插入基因片段相符約725bp;將重組質(zhì)粒按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察到各

4、組細(xì)胞生長情況不同:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒組細(xì)胞生長狀態(tài)較差,大量細(xì)胞出現(xiàn)胞膜不明顯,細(xì)胞核碎裂,細(xì)胞形態(tài)混亂,空白對照組細(xì)胞無明顯改變。于轉(zhuǎn)染后48小時換液,收集各組細(xì)胞上清液,并用ELISA測定各組中是否有人-β-NGF蛋白的表達(dá)情況。NGF蛋白ELISA檢測結(jié)果:A、重組質(zhì)粒組為174.91±4.71pg/ml,B、空質(zhì)粒組為5.94±0.91pg/ml,C、Lip2000組為5.71±0.50pg/ml,

5、D、陰性對照組為5.79±0.80pg/ml,重組質(zhì)粒組NGF蛋白表達(dá)量明顯比其他各組NGF蛋白表達(dá)量高。
　　結(jié)論：采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法能成功的將NGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)轉(zhuǎn)染后攜帶NGF質(zhì)粒的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞仍有增殖、分化能力,并且具有了NGF蛋白的表達(dá)能力,其表達(dá)的NGF蛋白能有效的保護(hù)轉(zhuǎn)染過程中對細(xì)胞的損害,這些研究結(jié)果,可以為我們下一步應(yīng)用β-NGF修飾的BMSC進(jìn)行耳蝸