TRAIL基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、 目的：探討Trail基因在體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用基因治療的可行性以及轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞能否保持增殖及分化特性。方法：實驗共分兩部分 第一部分；(1)從 12~14 天孕齡的大鼠胎鼠腦中分離出神經(jīng)干細(xì)胞,并用無血清培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)并傳代；用免疫熒光對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定；(2) 取傳至第3~4代神經(jīng)干細(xì)胞,分別按感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為0、1、5、10、20加入攜帶綠色熒光蛋白(green

2、fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒載體(Lentivirus vector)稀釋液。于熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達(dá)效率并攝片,行流式細(xì)胞儀檢測以及神經(jīng)球計數(shù),得出各組 NSCs的GFP陽性轉(zhuǎn)染率以及神經(jīng)干細(xì)胞球生成率。第二部分；(1)取傳至第3~4代神經(jīng)干細(xì)胞,用最適感染復(fù)數(shù)的慢病毒介導(dǎo)的GFP-TRAIL融合基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞,觀察目的基因轉(zhuǎn)染情況及 LV/TRAIL-GFP 對神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響,利用免

3、疫熒光及western-blot鑒定TRAIL基因在神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)情況；(2)對轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行Nestin鑒定,再將轉(zhuǎn)染后以及未轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞接種于用 1%多聚賴氨酸包被的蓋玻片上,用含 10%胎牛血清和BMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的分化情況,并通過免疫熒光鑒定分化的細(xì)胞。結(jié)果：第一部分；(1)經(jīng)無血清培養(yǎng)的細(xì)胞呈懸浮生長,可形成大小不等的細(xì)胞球,對細(xì)胞行免疫熒光染色呈現(xiàn)Nestin陽性。(

4、2)轉(zhuǎn)染報告基因GFP后,除MOI值為0的空白對照組外,熒光顯微鏡下觀察其余各孔在 2~3 天后均有綠色熒光的GFP陽性表達(dá)。MOI值從0增至10,經(jīng)流式細(xì)胞檢測GFP陽性表達(dá)率逐漸提高(P<0.05),MOI值為10的組可獲得>90%的轉(zhuǎn)染率。經(jīng)細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)MOI值從10增至20,形成的神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)目卻明顯減少(P<0.05)。第二部分：(1)將慢病毒介導(dǎo)的GFP-TRAIL融合基因以MOI值10轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞,GFP綠色熒光2

5、4小時開始出現(xiàn),72小時達(dá)最高分值,并且可以穩(wěn)定表達(dá),轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞能增殖并傳代。Western-blot結(jié)果顯示 GFP-TRAIL 融合蛋白能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),對轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞行免疫熒光染色結(jié)果顯示Trail表達(dá)蛋白陽性。(2)轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光染色呈現(xiàn)Nestin陽性。對轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞行誘導(dǎo)分化,轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞能分化神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,且與未轉(zhuǎn)染組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,對轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)元及神經(jīng)膠