rAAV-2-EGFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞及植入MCAO大鼠紋狀體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分：SD大鼠胚胎大腦皮質(zhì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及增殖分化的實(shí)驗(yàn)研究。 目的:探討從SD大鼠胚胎大腦皮質(zhì)額葉、頂葉體外分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell，Nscs)。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用含表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)及無血清培養(yǎng)添加劑B2

2、7(B27 supplement)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)孕13.5天的SD大鼠胚胎大腦皮質(zhì)額葉、頂葉NSCs。原代細(xì)胞克隆球形成后，以單細(xì)胞克隆、Brdu摻入及免疫熒光和Nestin免疫熒光證實(shí)所獲得的神經(jīng)細(xì)胞克隆球具有強(qiáng)分裂增殖能力和胚胎源性；另一部分細(xì)胞用含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，一周后分別進(jìn)行微管相關(guān)蛋白(microtubule associated pr

3、oteins-2，MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillar)，acidic protein，GFAP)免疫熒光染色檢測(cè)以證實(shí)來源于孕13.5天大鼠額葉、頂葉皮質(zhì)腦組織的NSCs具有分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化潛能。 結(jié)果：原代培養(yǎng)1周后，可形成大量懸浮生長(zhǎng)的克隆球?？寺∏蚪?jīng)免疫熒光法檢測(cè)BrdU和Nestin均呈陽性，單細(xì)胞克隆可獲得大量的NSCs，誘導(dǎo)分化后，分化細(xì)胞MAP-2、GFAP免疫熒光呈

4、陽性。 結(jié)論：可以從SD大鼠胚胎大腦皮質(zhì)額葉、頂葉中分離培養(yǎng)純化、擴(kuò)增傳代獲得NsCs，作為進(jìn)一步研究的NSCs來源。 第二部分：2型腺相關(guān)病毒重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：探討2型重組腺相關(guān)病毒(recombinam adeno-associated virus 2，rAAV-2)載體能否有效地轉(zhuǎn)染NSCs。 方法：采用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced gre

5、en nuorescem protein，EGFP)報(bào)告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP)，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)分別為1×10<'4>、1×10<'5>、1×10<'6>轉(zhuǎn)染體外分離、培養(yǎng)的大鼠胎鼠NSCs，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)子代細(xì)胞的活力、增殖倍數(shù)、分化情況來評(píng)估對(duì)其存活、增殖、分化能力的影響；當(dāng)EGFP表達(dá)穩(wěn)定后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV-2/EGFP

6、對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染10天后各轉(zhuǎn)染組便可觀察到NSCs克隆球發(fā)出綠色熒光，起始熒光強(qiáng)度不一，隨MOI值的增大而增強(qiáng)；各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，至轉(zhuǎn)染21天后達(dá)高峰并維持，此時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV-2對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)染效率：MOI為1×10<'4>、1×10<'5>、1×10<'6>時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為26.34％、50.97％、56.36％。熒光指數(shù)(FI)分別為4.01、12.70、14.08；轉(zhuǎn)染組和未

7、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)7、14、21天時(shí)其細(xì)胞活力、增殖倍數(shù)、分化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：rAAV-2能有效地轉(zhuǎn)染NSCs，所介導(dǎo)的目的基因能高效表達(dá)。 第三部分：rAAV/EGFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞植入局灶性腦缺血大鼠紋狀體的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：探討以rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)植入局灶性腦缺血(MCAO)模型大鼠紋狀體內(nèi)的遷移、分化表型及其對(duì)神經(jīng)功能、學(xué)

8、習(xí)與記憶能力的影響。 方法：rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的NSCs。大鼠隨機(jī)分為3組：1.正常對(duì)照組：即rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染的NSCs植入正常大鼠紋狀體內(nèi)；2.腦缺血對(duì)照組：即生理鹽水植入局灶性腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)；3.腦缺血實(shí)驗(yàn)組：即rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染的NSCs植入局灶性腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)(均n=6)。線栓法制成腦缺血對(duì)照組、腦缺血實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)：立體定向下向大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注射相應(yīng)

9、的移植物，移植后1周、2周、3周、4周、8周，神經(jīng)功能評(píng)分，同時(shí)進(jìn)行Y型電迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)與記憶能力，用免疫熒光組織化學(xué)方法來檢測(cè)移植NSCs的遷移、分化。 結(jié)果：腦缺血實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分、學(xué)習(xí)與記憶能力與腦缺血對(duì)照組相比較有顯著性差異(P<0.05)。腦缺血實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組植入的NSCs能在宿主體內(nèi)存活，并與宿主有了一定的相容性。移植后第3周，腦缺血實(shí)驗(yàn)組針道內(nèi)有少許植入的rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染的NSCs向針道外遷

10、移，第4周，針道內(nèi)遷移的細(xì)胞不均勻地分布在其兩側(cè)，有向損傷灶遷移的趨勢(shì)，未見明顯細(xì)胞突起。至移植后第8周，植入的rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染的’NSCs不但向損傷灶遷移，而且分化成神經(jīng)系統(tǒng)成熟細(xì)胞的形態(tài)，胞漿和突起均可見綠色熒光。分化的部分細(xì)胞可表達(dá)MAP-2，即有GFP/MAP-2雙陽性細(xì)胞，說明移植的細(xì)胞可分化為神經(jīng)元，但數(shù)目較少；另一部分細(xì)胞可表達(dá)GFAP，即有GFP/GFAP雙陽性細(xì)胞，說明移植的細(xì)胞也可分化為膠質(zhì)細(xì)胞，且數(shù)目較多