pegfp—c2基因轉(zhuǎn)染恒河猴骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的實驗研究

1、中華 神 經(jīng) 醫(yī)學(xué) 雜志 2 0 0 4年 3月 第 3卷 第 2期 C h i nJNe u r o me dV o l3N o2Ma r2 0 0 4p E G F P — C 2 基 因轉(zhuǎn)染恒 河猴骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞 的實驗研究 徐 強(qiáng) ， 徐如 祥 ， 姜曉 丹 ， 張世 忠 ， 鄒 雨 汐( 第一 軍 醫(yī)大學(xué)珠 江 醫(yī)院神 經(jīng)外科 ， 廣 東 廣 州 5 1 0 2 8 2 )· 8 5·· 論

2、著 ·摘 要 ： 目的 探 討 恒 河 猴 骨 髓 基 質(zhì) 源 神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 進(jìn) 行 基 因修 飾 的 可 行 性 。 方 法 分 離 恒 河 猴 骨 髓 基 質(zhì) 細(xì) 胞 ( B MS C s ) ， 體 外 培 養(yǎng) ， b F G F誘 導(dǎo) 增 殖 ， 細(xì) 胞 生 長 至 神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 期 時 以 Nu c l e o f e c t o r T M 核 轉(zhuǎn) 染 儀 行 p E G F P — C 2轉(zhuǎn) 染 ，

3、倒 置 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 基 因表 達(dá) 情 況 ，并 檢 測 細(xì) 胞 的活 力 。 另 外 ，對 同 期 培 養(yǎng) 的 未轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 進(jìn) 行 神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 特 異 性 抗 原 一 n e s t i n和 C D1 3 3抗 原 的 免疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 檢 測 。結(jié) 果 分 離 得 到 的 B MS C s 能 在 體外 培 養(yǎng) 液 中進(jìn) 行增 殖 和分 化 ， 而 在 b F GF誘 導(dǎo) 的 情 況下 ． 細(xì)胞的增

4、殖 更為明顯 ； 轉(zhuǎn)染 p E G F P — C 2的細(xì)胞 于轉(zhuǎn) 染后 2 4h后 即表達(dá)強(qiáng)綠 色熒光蛋 白， 轉(zhuǎn)染 率達(dá) 3 0％以上 ， 且 細(xì) 胞 的 活 力 基本 不受 影 響 ； 免疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 檢 測 可 見 有 n e s t i n和 C D1 3 3抗 原 在 同 期 培 養(yǎng) 的 未轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 內(nèi) 表達(dá) 。 結(jié)論 靈 長 類 骨 髓 基 質(zhì) 細(xì)胞 具 有 向神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 分 化 、 增 殖 的 能 力

5、 ， b F G F能促 進(jìn) 細(xì) 胞 的 增殖 ， 在 神 經(jīng) 干細(xì) 胞 培 養(yǎng) 條 件 下 ， 可 發(fā) 育 分 化成 神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 ； 在 神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 階段 ， 應(yīng) 用 電 轉(zhuǎn) 染技 術(shù) 進(jìn) 行 神 經(jīng) 干 細(xì)胞 基 因修 飾 是 可 行 的 ， 可 應(yīng) 用 于 骨髓 基 質(zhì) 源 神 經(jīng) 干 細(xì)胞 的基 因治 療 領(lǐng) 域 。關(guān)鍵 詞 ： 骨髓 基 質(zhì) 細(xì)胞 ； 神 經(jīng) 干 細(xì)胞 ； E G F P ； 基 因轉(zhuǎn) 染 ；

6、恒河 猴 中圈分類號 ： Q8 1 3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： A文章編號 ： l 6 7 l 一 8 9 2 5 ( 2 0 0 4) 0 2 — 0 0 8 5 — 0 0 4 T h es t u d yo nt h et r a n s f e e t i o no fp EGF P- C2g e n ei n t ot h en e u r a ls t e m c e l l sd e lv e df r o m t h eb o

7、 n em s r r o w s t r o m a lc e l l so fr h e s u sm o n k e yX UQi a n g ， x uR u x i a n g ， J I A NGXi a o d a n ， Z H A NGS h i z h o n g ， Z O UYu x iO e p a r m a e n to f N e u r o s u r g e r y ， Z h u j i a n

8、gH o s p i t a l ， F i r s tMi l i t a r yMe d i c a lU n i v e r s i t y ， G u a n g z h o u510 2 8 2 ， C h i n aA b s t r a c t ： Ob j e c t i v eT oe x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo f p E G F P - C 2g e n et r

9、a n s f e c t i o ni n t ot hen e u r a ls t e m c e l l sS C s ) d e r i v e df r o m t heb o n ema r r o ws t r o ma lc e l l sr B MS C s ) o fr h e s u smo n k e y ． M e t h o d sT h eB MS C si s o l a t e df r o m

10、 a d u l tr h e s u smo n k e ywe r ec u lt u r e d wi t h DN I I 三 M ／ F1 2a n d i n d u c e dt o p r o l i f e r a t e wi t h b F GF Ⅵ e nBM S C s we r e d i f e r e n t i a t e di nt oNS Cs , p EGF PC 2g e n ewa s t r

11、 a n s f e e t e di nt on u c l e u s b y Nu c l e o f e c t o r r M d e v i c e ． T h e nt he c e l l s we r eo b s e r v e du n d e r a n i nv e r t e df l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p et oe x a mi n et heg e

12、n ee x p r es s i o n 。a n df i n a l l yt hec e l l u l a rv i t a l i t ywa sd e t e c t e d ．I na d d i t i o n ． t hes y n c h r o n o u s l yc u l t u r e db u tn o n—mms f ec t e dc e l l swe r ee v a l u a t e dwh

13、 e t he rt h e yc o u l dp r e s e n tNe s t i na n dCD1 3 3a n t i g e nb yd o u b l e — l a b e l l e dme t ho d ．Re s u l t sTh eB M S Csi s o l a t e df r o m b o n ema r r o w c o u l dp r o l i f e r a t ea n dg

14、e n e r a t ec l o n ewh e n t he ywe r ec u l t u r e di n v i t r o ． M o r e o v e r ． t h e s ec e l l sc o u l dg r o w mo r er ap i d l ywh i l ea d d i ngb F GFi nt ot hec u lt u r eme d i u m．T h ec e l st r

15、a n s f e r r e dwi t h p EGF P — C2b vNu c l e o f e c t o r T M d e v i c ea f t e r2 4h o u r sc o u l ds t r o n g l ye x p r e s sg r e e nf l u o r es c e n c eu n d e raf l u o r e s c e n c emi c r o s co p e ,

16、t he i r t r a n s f ec t i o ne f f i c i e n c yu Dt 03 0％ ． a n dt hep r i ma r yc e l l u l a r v i t al i t y wa sa l mo s t ma i nt ai ne d ． T h ee x p r e s s i o no fn e s t i na n dCD1 3 3a n t i g e nwe r ef o

17、 u n di n t hes y n c h r o n o u s l yc u l t u r e db u tn o n ． t r a n s f e c t e dc e l l s ．Co n du s i o nBM S Csd e r i v e d f ro m p r i ma t eh a v et h ea b i l i t vo fd i fe r e n t i a t i o ni nt oNS

18、 Csa n dp r o l i f e r at i o nwh i l eb F GFC a n a c c e l e r at et hep r o l i f e r a t i o n ．I ti Sf e a s i b l et ol r a n s f e c tt he r a p e u t i cg e n ei nt oNS Csd e r iv e df ro m t heB M S Cso fr h

19、 e s u smo n k e ywi m Nu e l e o f e c t 0d e v i c e ． wh i c hC a n b ea p p l i e di nt heg e n et h e mp y0 f NS Csf r o m B M S Cs ．Ke ywo r d s ： b o n er l l a l T O W s t r o ma lc e l l s ； n e u r a ls t e

20、 m c e l l ； EGF P ： g e n et r a n s f ec t i o n ； r h e s u smo n k e y ．骨髓 基質(zhì)細(xì)胞 ( b o n ema r r o ws t r o ma lc e l l s 。 B MS C s )是 骨髓 細(xì)胞 中除 去造 血 干 細(xì)胞 ( 非 粘 附 細(xì)胞 ) 之外 的 細(xì)胞 部分 ( 粘 附細(xì)胞 ) ， 由于在 骨髓 體外 培養(yǎng) 時發(fā) 現(xiàn)其 粘 附 于塑

21、料器 皿表 面并 具有 克隆樣 增殖 特性 ， 因此也 稱 之 為塑 料粘 附細(xì) 胞 ( p l a s t i c — a d h e r e n tc e l l s ) 、 克 隆形 成 單 位 成纖 維 細(xì) 胞 ( c l o n g — f o r mi n g — u n i tf i b r o b l a s t ) 或 骨髓 間質(zhì) 干細(xì)胞 ( b o n e ma r r o wme s e n c h y ma ls

22、 t e mc e l 1 ) 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 _ _ 。 _ _ 。 _ ● _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ● _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ● _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ● _ _ 。 。 ● 。 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

23、_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ J _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ J _ _ _ ● - 收稿 日期 ： 2 0 0 3 -1 l - 2 5基金項 目： 廣東省科技廳【 粵科基辦 (

24、 2 0 0 0 ) 2 5 、 粵財 ( 2 0 0 1 ) 3 6 7 ] ； 國家 自然科 學(xué)基金 ( 3 0 2 7 0 4 9 1 )作者■ 介 ： 徐強(qiáng) ( 1 9 7 1 一) ， 男 ， 河南新 蔡人 ， 第一 軍醫(yī)大學(xué)在讀博士 ， 主 治醫(yī)彝 。 電話 ： 0 2 0 - 6 1 6 4 3 2 6 3 。 E m a i l ： q i a n g ． x u @ 1 6 3 ． n e tWo o d b u r

25、y D【 1 ] 和 S a n c h e z - R a mo s J [ 3等分 別在不 同的實 驗 室將 鼠和 人 的骨髓 基 質(zhì) 細(xì)胞 向神 經(jīng)元 和膠 質(zhì) 細(xì)胞 方 向誘 導(dǎo)分 化成功 。本 實驗 以恒河 猴 為實驗對 象 ， 觀 察 靈長 類動 物骨髓 基質(zhì) 細(xì)胞 體外擴(kuò) 增 、 分 化 的情況并 用 電轉(zhuǎn) 染方 法對 骨髓 源神經(jīng) 干細(xì)胞 進(jìn)行 基 因修 飾 ， 旨 在 為未來 臨 床應(yīng) 用 自體 骨髓 源性 神 經(jīng) 干

26、細(xì) 胞 移植 修 復(fù) 中樞 神經(jīng) 系統(tǒng) 功能損 害奠 定實 驗基 礎(chǔ) 。1材 料 與 方 法 1 ． 1 實驗 動 物 、 試 劑 和 主要 儀 器 由華 南 靈長 類 動物 實 驗 中心 提供 經(jīng) 檢疫 健康 的 維普資訊 http://www.cqvip.com 第 3卷 第 2期 徐強(qiáng) ， 等 ． p E GF P — C 2基 因轉(zhuǎn) 染 恒 河猴 骨髓 源神 經(jīng) 干 細(xì) 胞 的實 驗 研 究 主 ， 見 圖 l ， 2 。2 ．

27、 2 同期培 養(yǎng)的 未轉(zhuǎn) 染細(xì)胞 免疫 組化 染 色 同期 培 養(yǎng) 的 未轉(zhuǎn) 染 細(xì)胞 免 疫 組 化染 色 ．結(jié)果 顯 示 ： B MS C s 接種 至 神經(jīng) 干細(xì) 胞培 養(yǎng) 基后 第 1 0d ， 細(xì)胞 表 達(dá) n e s t i n抗原 陽性 ， 熒 光 顯微 鏡下 發(fā)綠 色熒 光 。調(diào) 整熒 光顯 微鏡 的視 野 明暗度 ． 同時可見 細(xì)胞 膜表 達(dá)有 C D1 3 3抗 原 ， 呈鮮 紅 色 ， 表 明這 一 時期 的 細(xì)胞

28、 為 神經(jīng) 干 細(xì)胞 ， 見 圖 3 。圍 3熒 光顯 徽 鏡 下 B MS Cs 免疫 組 化 染 色 ( x 2 0 0 )B MS C su n d e rt h ef l u o r e s c e n c emi c r o s c o p e ( x 2 0 0 )C e l l sa r eb o t hN e s t i np o s i t i v e ( g r e e n ， r a b b i ta n t i

29、— n e s t i na n dc a p r i n ea nt i — r a b b i t — F I T C ) a ndC Dl 3 3p o s i t i v e ( r e d ． mo u s ea n6 —： Dl 3 3 ． S AB C — P 0 D． A E C) , wh i c hi n d i c a t e st h e ya r en e u r a ls t e m c e l l s ．

30、2 ． 3 細(xì)胞 轉(zhuǎn)染 2 4d后倒 置 熒光 顯微鏡 下觀 察 分 別記 錄每 個轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞培 養(yǎng)孔 四周 和 中央 5個 視 野 內(nèi) 明視野 和 暗 視野 所 觀 察 到 的細(xì)胞 數(shù) 。按轉(zhuǎn) 染 率 一暗 視野 所 見 發(fā) 強(qiáng)綠 色熒 光 的細(xì)胞 數(shù) ／ 明 視 野 所 見 細(xì)胞 數(shù)計 算轉(zhuǎn) 染 率 。觀察 可 見 ( 圖 4 ) ： 強(qiáng) 表達(dá) 綠 色 熒 光蛋 白的細(xì)胞散 在 分布 ；另有 部分 細(xì)胞 呈淡 綠色 ，可能 與轉(zhuǎn)

31、染 后 時 間較短 、 p E GF P — C 2表 達(dá) 的程 度較 弱 有關(guān) ； 還有 部 分細(xì)胞 不 發(fā)熒 光 ， 轉(zhuǎn) 染 率 約為 3 0％。圖 5可見強(qiáng) 表達(dá)綠 色熒 光蛋 白的細(xì)胞 。2 ． 4 細(xì)胞 成 活率 用苔 酚藍(lán) 排斥試驗分別 檢測 同期培養(yǎng) 的未轉(zhuǎn)染 細(xì) 圍 4轉(zhuǎn)染 2 4 h后 NS Cs 表 達(dá) 綠 色 熒 光 蛋 ~( x l 0 0 )晷 4Gr e e nF l u o r e s c e n c eP

32、 r o t e i n( GF P ) i se x p r e s s e di n NS C s2 4ha l t e rp E GF P - - C 2g e n et r a n s f e c f i o n ( x l 0 0 1_ + C e l l se x p r e s s e dE GF Ps t r o n g l y ．tCe i l se x p r e s s e dE GF Pwe a k l y ．C

33、e l l sd i dn o te x p r e s sE GF P ．· 8 7·圖 5 轉(zhuǎn) 染 2 4 h 后 NS C s 強(qiáng) 表達(dá)綠 色熒 光蛋 白( )0 o )Fi g ． 5GF P i se x p r e s s e ds t r o n g l yi n NS Cs2 4h o u m a f t e rp E GF P - C 2g e n et r a n s f e c f i o

34、 n ( x 2 0 0 )胞和轉(zhuǎn) 染后 2 4 d細(xì)胞 的成活率 。 分別是 9 8 ％和 9 0 ％。3 討 論 近 年來 研 究 發(fā)現(xiàn) 。神 經(jīng)干 細(xì)胞 具 有 分化 為 神經(jīng) 元 、 星形 膠質(zhì) 細(xì)胞 、 少突膠 質(zhì) 細(xì)胞 的能力 ， 能 自我更新 并 足 以提 供治 療 神經(jīng) 系統(tǒng) 損傷 和 神 經(jīng)退 行性 病 變 的 腦 細(xì)胞 ， 而成 為神 經(jīng)科學(xué) 界研 究 的熱 點(diǎn) 。其 中骨髓 基 質(zhì)細(xì)胞 ( B MS C s )也

35、是一 種具 有 多 分化 潛 能 的干 細(xì) 胞 。 不但 可 以形 成起 源 于 中胚 層 的心 肌 、 骨 骼肌 和 平 滑肌 等細(xì) 胞 。還 能 形成 起 源 于外 胚 層 的神 經(jīng) 系細(xì) 胞 ]。 同時 ， 骨髓 基 質(zhì)細(xì)胞 容易 獲取， 可 以在體 外大量 擴(kuò) 增 。 而 且在一 定條 件下 可誘 導(dǎo)成 神經(jīng) 細(xì)胞 并用 于 自體 移植。 為神 經(jīng)干 細(xì)胞 的應(yīng) 用提 供 了無 限制 的來 源 。骨 髓源 神經(jīng)干 細(xì)胞 ( B

36、MS C s - NS C s ) 的開 發(fā)和應(yīng) 用 ， 能有 效克 服從 腦組 織獲 取 神經(jīng) 干細(xì)胞 的危險 性 和局 限性 。也避 免 了胎腦組 織移植所存在 的倫理 、 免疫排 斥 、 來源 有限等問題 。已有實驗 證實 ， 將人 B MS C s 直接注射到 異種動 物腦 內(nèi) 。 B MS C s 可表現(xiàn) 出類似 神經(jīng)干細(xì) 胞 的特 性如遷移 、 整合 等_ 5 】 。 而將 來源 于成年 鼠的 B MS C s 注射 到新生

37、小 鼠的室周 區(qū)后 ， 部分 B MS C s 分化為星形膠質(zhì) 細(xì)胞 ， 注射 到富 含神 經(jīng)元 的腦 組織 內(nèi) ， 大部 分 B MS C s則分 化成 神經(jīng)元 _ 6 】 。 可見 B MS C 的分化具 有多 潛能性 及位 置決 定性 。但 B MS C s 的定 向分 化誘 導(dǎo)仍 是神經(jīng) 科 學(xué)研 究 的難 點(diǎn) 和重 點(diǎn) 。 而轉(zhuǎn) 基 因技 術(shù) 為 B MS C s的 定 向分化 提供 了技 術(shù)平 臺 。目前 ， 靈 長類 B

38、MS C s向神經(jīng) 干 細(xì)胞誘 導(dǎo)并 進(jìn) 行 報 告基 因修飾 的研 究鮮有 報道 。 本 實驗進(jìn) 行 了骨髓 源 神 經(jīng)干 細(xì)胞 的培 養(yǎng) 、鑒 定 和 電轉(zhuǎn) 染 p E F G P — C 2等 研 究 ， 旨在 為移 植治療 應(yīng)用 奠定 基礎(chǔ) 。 許 多學(xué)者認(rèn) 為 ， 細(xì) 胞 基 因修飾 效 率 的影 響因素 主要 包括 ：( 1 ) 細(xì)胞 的來 源 和性 質(zhì) 。要求進(jìn) 行基 因轉(zhuǎn) 染 的細(xì)胞 達(dá)到一 定數(shù) 量 ，才能保 持較 高