shh基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:Sonic Hedeghog(SHH)基因通過(guò)上調(diào)多種血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)參與血管發(fā)生。內(nèi)源性的SHH途徑在發(fā)生心肌缺血后也會(huì)被激活,由于SHH基因有促進(jìn)血管新生的作用,因此SHH基因可能作為潛在的治療策略應(yīng)用于心肌缺血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可向肌性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化,在心肌缺血損傷后促進(jìn)新生血管形成和心肌重構(gòu),改善心功能。此外MSC還可接受多種載體的基因轉(zhuǎn)染并在體內(nèi)分化后仍可保持良好的遺傳穩(wěn)定性,故還可作為基因治療的靶細(xì)胞

2、。
　　 目的:研究對(duì)大鼠MSC進(jìn)行重組SHH基因修飾的可行性。為下一步基因與細(xì)胞聯(lián)合干預(yù)心肌缺血大鼠模型做好準(zhǔn)備。
　　 方法:克隆Wistar大鼠SHH基因并測(cè)序鑒定。構(gòu)建PCDNA3.1-SHH真核表達(dá)載體,采用密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法獲取Wistar大鼠MSC,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD44、CD45和SH3。采用Nucleofector電轉(zhuǎn)染方法將PCDNA3.1-SHH真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至MSC,

3、Western-Blot檢測(cè)鑒定SHH在MSC中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:RT-PCR擴(kuò)增的大鼠SHH基因編碼序列(CDS)片段,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定與Genebank一致。采用密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法可獲取大鼠MSC,檢測(cè)結(jié)果CD44、SH3陽(yáng)性,CD45、CD34陰性,Western-Blot檢測(cè)證實(shí)Nucleofector方法可將SHH基因轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠MSC,并獲得有效表達(dá),而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的MSC未檢測(cè)到表達(dá)。
　　 結(jié)論