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文檔簡介
1、目的1.構(gòu)建能夠較長時間表達(dá)人肝細(xì)胞生長因子的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.利用攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作用肺氣腫大鼠,評價其在治療大鼠肺氣腫病變中的作用,及初步探討相關(guān)修復(fù)機(jī)制。為肺氣腫基因及干細(xì)胞治療的提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法1.第一部分體外分離,培養(yǎng),鑒定大鼠MSCs,在不同MOI下,Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs,共聚焦顯微鏡下評價轉(zhuǎn)染效率,篩選出最佳轉(zhuǎn)染強(qiáng)度,在最佳轉(zhuǎn)染強(qiáng)度時將A
2、d-HGF轉(zhuǎn)染MSCs,并用ELISA法測定轉(zhuǎn)染后MSCs的hHGF表達(dá)水平,并用MTT發(fā)測定Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs對其增殖的影響。
2.第二部分體內(nèi)利用肝細(xì)胞生長因子基因修飾的MSCs對大鼠肺氣腫模型進(jìn)行轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞移植治療。32只wistar大鼠隨機(jī)分為4組:健康對照組(A組),病理對照組(B組),MSCs治療組(C組),Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSCs組(D組),單純被動煙熏法復(fù)制大鼠肺氣腫模型,通過尾靜脈給予生理鹽水,M
3、SCs,MSC/HGF。4周后觀察大鼠動脈血?dú)?,肺部病理變化,免疫組化分析肺部細(xì)胞增殖及血管密度變化,TENEL法測定肺部細(xì)胞凋亡情況。另外免疫熒光雙染測定MSCs在肺部的定居及分化,同時觀察Ad-GFP轉(zhuǎn)染的MSC在肺氣腫大鼠體內(nèi)向肺部的定向遷移及外源基因表達(dá)情況。
結(jié)果1.成功分離,培養(yǎng),鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
2.在感染濃度MOI=200時,Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs達(dá)到最高轉(zhuǎn)染效率,Ad-HGF成功轉(zhuǎn)
4、染MSCs,hHGF持續(xù)表達(dá)120h,在48h時,表達(dá)量最高。
3.Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs不會影響MSCs的活性,及在肺氣腫大鼠肺部的定向遷移,并GFF基因在肺部成功表達(dá)。
4.免疫熒光雙染顯示,部分MSCs在大鼠肺部分化為肺上皮細(xì)胞。
5.動脈血?dú)夥治觯委熃M(C組,D組)氧飽和度,氧分壓較病理對組明顯改善(P<0.05),且MSCs/HGF更具優(yōu)勢。
6.肺病理及免疫組化分析
5、:治療組(C組,D組)平均肺泡數(shù),肺實(shí)質(zhì)比,細(xì)胞增殖指數(shù)(PI),平均血管密度明顯增加(P<0.05);平均肺泡面積,平均內(nèi)襯間隔,肺部細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)明顯減少(P<0.05),并且MSCs/HGF治療效果更明顯(P<0.05)。
結(jié)論1.MSCs是一種理想的基因載體細(xì)胞,可用于肝細(xì)胞生長因子的基因治療。
2.Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs,可以定向遷移到肺氣腫大鼠肺部,且外源基因得到表達(dá)。
3.
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