肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景及目的：目前心血管疾病已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一,尤其以心肌缺血性疾病(ischemic heart disease,IHD)最為常見(jiàn),而心肌梗死(myocardialinfarction,MI)作為其中最為嚴(yán)重的一種類(lèi)型是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前,藥物、介入以及外科手術(shù)等心肌梗死的常用治療方法雖可使心臟閉塞的血管再通,改善心肌缺血和充血性心力衰竭(congestive heartfailure,CHF)的癥狀,但卻不能從根本

2、上恢復(fù)心肌細(xì)胞數(shù)量,改善心臟舒縮功能。心臟移植雖可從根本上解決心室重構(gòu)問(wèn)題,但因受到技術(shù)、供體來(lái)源、費(fèi)用以及社會(huì)、倫理道德等多種限制,目前尚無(wú)法廣泛應(yīng)用。隨著組織工程學(xué)及干細(xì)胞研究的深入,干細(xì)胞的分離、純化以及體外定向分化的技術(shù)得到了很大程度地提高。通過(guò)誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞移植來(lái)代替壞死心肌細(xì)胞,理論上可能達(dá)到改善心功能的目的,為心梗的治療提供了一種新的研究方向。但并非任何干細(xì)胞都能擔(dān)當(dāng)這一角色,胚胎干細(xì)胞(embr

3、yonic stem cells,ESs)和骨骼肌干細(xì)胞就被排除,前者由于來(lái)源及倫理問(wèn)題應(yīng)用受限,而后者因?yàn)榉只墒旌鬅o(wú)法與宿主細(xì)胞建立電機(jī)械偶聯(lián)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體,主要存在于網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi),而且在體外特定的誘導(dǎo)條件下,可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等,還具有取材方便、連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能的優(yōu)點(diǎn),并已有

4、眾多研究證實(shí)其可用于自體移植。故而,誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞并將之通過(guò)細(xì)胞移植用于心肌梗死的治療目前已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一。目前,誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化的研究主要集中于化學(xué)誘導(dǎo)分化,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)被證實(shí)是最有效化學(xué)制劑,但其誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率也始終低于20％~30％,且具有細(xì)胞毒性作用,臨床應(yīng)用受到極大地限制,這就使尋找更為合適的誘導(dǎo)劑成為研究的熱點(diǎn)。有研究認(rèn)為,某些細(xì)胞因子如

5、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth facto,HGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)等在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞定向分化中起著重要的作用,并有足夠的理論和實(shí)驗(yàn)表明使用細(xì)胞因子作為誘導(dǎo)分化劑在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞可能具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值,而且相比5-氮胞苷等眾多已有研究的化學(xué)物質(zhì),細(xì)胞因子沒(méi)有細(xì)胞毒性作用,是較為理想的干細(xì)胞誘導(dǎo)劑。HGF是

6、由間質(zhì)細(xì)胞分泌的一種多功能的細(xì)胞因子,它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng),促進(jìn)多種細(xì)胞組織形態(tài)的發(fā)生等作用;它還是一種心肌營(yíng)養(yǎng)因子,具有很強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂,修復(fù)內(nèi)皮損傷,抑制細(xì)胞凋亡與組織重構(gòu)的作用。近年來(lái)MSCs向心肌細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)研究多局限于細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn),而人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Bone Marrow messenchymal Syem Cells,hMSCs)的體外分離、純化、定向誘導(dǎo)的研究報(bào)道尚少,關(guān)于HGF

7、誘導(dǎo)hMSCs向心肌細(xì)胞分化的研究報(bào)道就更為鮮有。結(jié)合上述研究現(xiàn)狀,本研究選擇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)作為研究對(duì)象,采用密度梯度離心法及貼壁篩選法分離純化hMSCs,并在體外用不同濃度的HGF誘導(dǎo)分離純化后的hMSCs,旨在探討HGF是否能成功誘導(dǎo)hMSCs向心肌細(xì)胞分化以及HGF的濃度對(duì)MSCs的誘導(dǎo)作用是否有影響。
　　材料與方法:1.標(biāo)本:骨髓來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科2007年~2008年非青紫型先天性心臟病

8、患者,所有患者術(shù)前均排除血液系統(tǒng)疾病,并征得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。2.處理:胸骨穿刺抽取骨髓3~5ml骨髓,肝素(100U/ml)抗凝后即送實(shí)驗(yàn)室,按比例加入percoll分離液(密度1.073g/mL)行密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,再利用貼壁篩選法純化hMSCs后,進(jìn)行原代傳代培養(yǎng)。3.分組:取第3代傳代細(xì)胞,分為6組:①~⑤組為實(shí)驗(yàn)組,分別加入3μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和40μg/L HGF

9、,連續(xù)培養(yǎng)4w,每3d換液1次;⑥組為陰性對(duì)照組,不加入HGF,其余條件與實(shí)驗(yàn)組相同。4.結(jié)果判定:所有分組均在顯微鏡下連續(xù)觀(guān)察誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)變化,并詳細(xì)記錄;再于第四周行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI)及心肌特征性蛋白縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá),胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,用cTnI陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)算轉(zhuǎn)化率。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用Kruskal-Wall

10、is H檢驗(yàn)(H檢驗(yàn)),組間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.顯微鏡下連續(xù)觀(guān)察結(jié)果:經(jīng)HGF誘導(dǎo)的各實(shí)驗(yàn)組hMSCs均出現(xiàn)不同程度的增殖,誘導(dǎo)7d后hMSCs的形態(tài)即發(fā)生明顯改變,細(xì)胞緊密生長(zhǎng),體積明顯增大,紡錘形細(xì)胞比例下降,多為卵圓形或柱狀細(xì)胞,相鄰細(xì)胞間有接觸。2周后細(xì)胞之間連接愈加緊密。3~4周后,細(xì)胞增殖速度減慢,相鄰細(xì)胞間逐漸相連呈肌管狀,細(xì)胞核/胞漿比例明

11、顯降低,胞漿內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu),且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周?chē)?。陰性?duì)照組hMSCs無(wú)任何明顯改變。2.實(shí)驗(yàn)4周后,用免疫組化法鑒定cTnI、Cx43:在陰性對(duì)照組上述兩蛋白均呈陰性表達(dá),而在經(jīng)HGF作用后的5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均有一定的陽(yáng)性表達(dá)。其中,cTnI陽(yáng)性細(xì)胞百分率(％):3μg/L組為(14.24±0.46％)、5μg/L組為(25.32±1.41％)、10μg/L組為(38.46±1.41％)、20μg/L組為(27.38±1.

12、32％)、40μg/L組為(20.36±2.15％),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且以10μg/L組最高。
　　結(jié)論：1.hMSCs經(jīng)HGF誘導(dǎo)后的細(xì)胞間有肌管樣結(jié)構(gòu)形成,且存在cTnI、Cx43的陽(yáng)性表達(dá),出現(xiàn)可鑒定為心肌細(xì)胞的特異性免疫組化表現(xiàn),提示HGF在體外能夠誘導(dǎo)hMSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2.不同濃度HGF誘導(dǎo)的hMSCs轉(zhuǎn)化心肌細(xì)胞百分率不同,而10μg/L HGF誘導(dǎo)組相對(duì)轉(zhuǎn)化率最高,提示H