微小RNA-129促進骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化及其作用機制的探討.pdf

1、心肌梗死是近年來常見的心血管疾病，雖然常規(guī)的藥物和手術(shù)治療能夠一定程度的改善癥狀，但鑒于心肌細胞的不可再生性，以及心梗后梗死區(qū)由瘢痕組織替代，難以避免的會發(fā)生終末期心力衰竭，因此干細胞的心肌再生治療成為近年來的研究熱點。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSCs）憑借其易于培養(yǎng)、多向分化潛能、無倫理道德爭議等特點被認為是心肌再生治療中急劇前景的種子細胞之一。目前認為BM-MSCs

2、通過多種途徑參與修復(fù)心肌梗死后的心肌細胞損傷，主要包括：對抗凋亡、促血管新生、動員外周干細胞、旁分泌所衍生的復(fù)合效應(yīng)、心肌分化途徑等。但是參照以往的文獻提示：BM-MSCs在注射入心肌后，向心肌細胞分化的比率極低，因此針對于誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細胞分化的研究具有重要的意義。目前認為BM-MSCs在體外誘導(dǎo)下向心肌細胞分化的具體機制涉及多條信號通路以及多種節(jié)點蛋白的聯(lián)合效應(yīng)，具體機制尚待進一步研究。在所有參與調(diào)控BM-MSCs向心肌細

3、胞分化所涉及的信號機制和基因調(diào)控過程中，我們認為Wnt信號通路是調(diào)節(jié)干細胞下游基因表達的關(guān)鍵信號之一，是哺乳動物系細胞生長發(fā)育、腫瘤形成等過程中不可獲取的組成部分，發(fā)揮著精確的調(diào)控作用。有研究證實在干細胞向心肌細胞分化的過程中有Wnt蛋白的參與，調(diào)節(jié)干細胞自我更新與分化之間的平衡，亦有研究發(fā)現(xiàn)外源性激活Wnt能夠開啟核下游心肌分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達。因此，我們認為在BM-MSCs向心肌細胞分化過程中Wnt信號通路扮演著重要的調(diào)控角色，研

4、究其內(nèi)源性調(diào)控機制對于明確如何促進BM-MSCs向心肌細胞分化具有重要的意義。
　　微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為20-24個核苷酸，成熟的miRNA能夠與靶信使RNA（message RNA，mRNA）3’UTR端的特定核酸序列互補識別，從而抑制或降解其mRNA的翻譯，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達，廣泛的存在于病毒、線蟲、植物動物體內(nèi)，并涉及幾乎所有的細胞增殖、凋亡、分化等生命過程

5、。有研究發(fā)現(xiàn)，在干細胞向心肌分化過程中，多種miRNA具有顯著的調(diào)控作用，其中部分miRNA正是通過開啟Wnt信號通路實現(xiàn)心肌分化相關(guān)的下游通路激活。本實驗研究通過構(gòu)建miRNA-129慢病毒載體，進而研究過表達miRNA-129是否能夠激活BM-MSCs內(nèi)的Wnt通路，從而開啟下游與心肌分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，最終促進BM-MSCs向心肌細胞分化。并針對miRNA-129在Wnt通路中的作用節(jié)點進行干預(yù)，進一步明確miRNA-129促

6、進BM-MSCs向心肌樣細胞分化的作用機制。
　　第一部分: BM-MSCs的體外獲取、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：利用密度梯度離心法獲取大鼠BM-MSCs，并進行體外培養(yǎng)和鑒定。
　　方法：采用2周齡SD(Sprague-Dawley rat)雄性大鼠，脫頸法處死，無菌條件下仔細剔除股骨部分的肌肉韌帶，DMEM低糖培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，采用密度梯度離心法獲取BM-MSCs，隨后接種于培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)BM-MSCs

7、貼壁的特性，經(jīng)過24小時培養(yǎng)后，棄除上清，移除游離細胞，胰酶法消化細胞離壁，進一步純化細胞后傳代接種。細胞傳至第二代，利用流式細胞儀鑒定BM-MSCs表面抗原分子CD90、CD29、CD45以及CD31的表達；利用成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞三系分化，檢測干細胞的體外分化能力。
　　結(jié)果：利用密度梯度離心法獲取的BM-MSCs經(jīng)過體外培養(yǎng)，傳代純化后，形態(tài)呈梭型、長短不一，符合BM-MSCs特性，細胞呈現(xiàn)集落樣生長，具有克隆形

8、成能力。通過流式細胞術(shù)鑒定，證明BM-MSCs高表達CD90和CD29；低表達CD45和CD31。利用特異性誘導(dǎo)劑對BM-MSCs進行誘導(dǎo)，證實BM-MSCs具有向骨、軟骨、脂肪三系分化的能力。
　　結(jié)論：利用密度梯度離心法獲取的BM-MSCs細胞，呈長梭形貼壁生長，表面抗原符合BM-MSCs的特性，且經(jīng)誘導(dǎo)能夠向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞分化，表明密度梯度離心法能夠有效分離BM-MSCs。
　　第二部分：慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染

9、構(gòu)建過表達目的基因的BM-MSCs
　　目的：利用慢病毒轉(zhuǎn)染分別構(gòu)建過表達miRNA-129的BM-MSCs（miR-129-MSCs），以及過表達GSK-3β的BM-MSCs（GSK-3β-MSCs）和同時過表達miRNA-129和GSK-3β的BM-MSCs（miR-129+GSK-3β-MSCs）。
　　方法：取第一部分中的BM-MSCs傳至第3代，實驗分為五組：①正常對照組（MSCs組）：未干預(yù)的BM-MSCs；②慢

10、病毒空轉(zhuǎn)組（Lv-MSCs組）：加入空載慢病毒載體轉(zhuǎn)染BM-MSCs（pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP），轉(zhuǎn)染12小時后更換為正常DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時，再次用空載的慢病毒載體（pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP）轉(zhuǎn)染12小時，置換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后加入嘌呤霉素培養(yǎng)基（10ug/ml）殺死未轉(zhuǎn)染細胞，再次更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；③miRNA-129過表達組（miR-129-MSCs）：加入包載mi

11、RNA-129的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12小時后更換為正常培養(yǎng)基；④GSK-3β過表達組（GSK-3β-MSCs）：加入包載GSK-3β的pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO慢病毒載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12小時后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，隨后加入嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選，殺死對照組細胞后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。⑤miRNA-129和GSK-3β雙轉(zhuǎn)染組（miRNA-129+GSK-3β-M

12、SCs），未干預(yù)的BM-MSCs先經(jīng)miRNA-129慢病毒轉(zhuǎn)染后再行GSK-3β慢病毒轉(zhuǎn)染，步驟同③④。隨后利用real-time PCR法檢測五組細胞中miRNA-129以及GSK-3β的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：上述各組BM-MSCs經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后行real-time PCR檢測目的基因，第③組中miRNA-129的基因表達量高于對照組（9.22±1.68 VS1.08±0.41，P＜0.05），第⑤組中miRNA-12

13、9的基因表達量高于對照組（9.68±3.73 VS1.08±0.41，P＜0.05）；第④組中GSK-3β的基因表達量高于對照組（14.73±3.42 VS1.01±0.34，P＜0.05），第⑤組中GSK-3β的基因表達量亦高于對照組（11.44±2.65 VS1.01±0.34，P＜0.05）。
　　結(jié)論：經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，成功獲得過表達miRNA-129的miR-129-MSCs組、過表達GSK-3β的GSK-3β-MSC

14、s組和同時過表達miRNA-129和GSK-3β的miR-129+GSK-3β-MSCs組，為后續(xù)的向心肌分化相關(guān)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　第三部分： miRNA-129促進BM-MSCs向心肌樣細胞分化機制
　　目的：探討體外條件下過表達miRNA-129對BM-MSCs向心肌樣細胞分化的影響，并探討其中可能涉及Wnt信號通路的機制。
　　方法：獲取第二部分中的五組細胞，常規(guī)低糖DMEM培養(yǎng)。設(shè)置以第②③④⑤組完成轉(zhuǎn)

15、染的當日為第0天，在時間點第5天、10天、15天、20天收取細胞，裂解后提取總RNA，利用real-time PCR檢測五組BM-MSCs中心肌特異性基因（Nkx2.5、GATA-4、MEF-2C）的表達；另取第15天的五組BM-MSCs，裂解后提取蛋白，利用western blot檢測心肌特異性蛋白（cTn-I、Desmin）的表達，以及非磷酸化β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK-3β的蛋白表達水平。
　　結(jié)果

16、：自第5天至第20天realtime-PCR提示第①②組中心肌特異性基因（Nkx2.5、GATA-4、MEF-2C）的轉(zhuǎn)錄水平基本無顯著變化，而第③⑤組中的心肌特異性基因（Nkx2.5、GATA-4、MEF-2C）轉(zhuǎn)錄水平隨時間延長逐漸升高，其中第3組的升高幅度顯著高于第⑤組（P＜0.01），第③組中心肌特異性基因的表達于第15天之后呈現(xiàn)不同程度的下降，仍顯著高于其余四組（P＜0.01）；此外第15天western blot檢測顯示，心

17、肌特異性蛋白（cTn-I、Desmin）第15天時在第①②④組中幾乎無表達，在第③組中呈顯著高表達趨勢而在第⑤組中僅有微弱的表達（P＜0.01），提示第③組BM-MSCs特異性向心肌樣細胞分化，而第⑤組BM-MSCs顯示出微弱的向心肌樣細胞分化的趨勢。我們于第15天時檢測GSK-3β表達量時發(fā)現(xiàn)第④⑤組中由于轉(zhuǎn)染目的基因的因素蛋白表達水平顯著高于其余三組，而在其余三組中第③組的GSK-3β僅有微弱的表達，第①②組顯著高于第③組（P＜0.

18、01）；鑒于非磷酸化β-catenin與磷酸化β-catenin的比值能夠反映Wnt信號通路的活化狀態(tài)，我們半定量檢測分析后發(fā)現(xiàn)第③組中非磷酸化β-catenin與磷酸化β-catenin比值均顯著高于其余四組（P＜0.01），此外第⑤組中的非磷酸化β-catenin與磷酸化β-catenin的比值略微高于第①②④組（P＜0.01），提示第③組中的Wnt信號通路明顯活化，而第⑤組中的Wnt信號通路亦有輕微激活的表現(xiàn)，可能的原因是第③組中

19、的miRNA-129針對復(fù)合抑制基團主要成員GSK-3β有明顯的抑制作用，而當?shù)冖萁M細胞外源性導(dǎo)入GSK-3β之后中和了miRNA-129針對GSK-3β的轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制結(jié)果，代償性的恢復(fù)對Wnt信號通路的抑制，因而表現(xiàn)出輕微的心肌樣分化表達。
　　結(jié)論：在沒有外源性誘導(dǎo)的情況下，過表達miRNA-129能夠顯著的促進BM-MSCs向心肌樣細胞分化，分析其機制可能是通過抑制GSK-3β的表達，進而穩(wěn)定維持β-catenin的非磷