miR-16促進(jìn)心肌微環(huán)境誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌表型細(xì)胞分化.pdf

1、目的:利用與新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)法誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(humanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,hBM-MSCs)向心肌表型(Cardiacphenotypiccells,CPs)細(xì)胞分化,檢測hBM-MSCs與Cps中微小RNA(microRNAs,miRNAs)表達(dá)譜差異,篩選誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞差異性表達(dá)的miRNAs,篩選可以誘導(dǎo)hBM-M

2、SCs向心肌表型分化的miRNAs,并研究其誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制。
　　方法:(1)采用骨髓直接貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hBM-MSCs。觀察原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)及增殖特點(diǎn),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物及誘導(dǎo)成脂分化等方法鑒定分離培養(yǎng)的hBM-MSCs。(2)用體外模擬心肌微環(huán)境,即利用非接觸共培養(yǎng)的原代新生SD大鼠心肌細(xì)胞(neonatalratventricularcardiomyocytes,NRVCs)誘導(dǎo)hBM-MSCs向C

3、ps分化。(3)利用miRNAs表達(dá)譜芯片檢測hBM-MSCs及Cps的miRNAs表達(dá)譜,篩選差異性表達(dá)的miRNAs。(4)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法,驗(yàn)證芯片中上調(diào)表達(dá)的miRNAs。(5)用非接觸共培養(yǎng)方法驗(yàn)證miRNA促hBM-MSCs向心肌表型細(xì)胞分化的作用,用PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、western-bloting、流式細(xì)胞術(shù)等方法研究miRNA誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)骨髓貼壁法分離所得到細(xì)胞,外形呈

4、長梭形,普通光鏡下單個(gè)細(xì)胞核,核質(zhì)比較大;用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物:CD29和CD44高表達(dá),而CD34和CD45表達(dá)水平很低。(2)采用Transwell六孔板共培養(yǎng)體系:上層小室接種NRVCs,下層小室接種hBM-MSCs,共培養(yǎng)后可以在Cps中檢測到GATA4、Nkx2.5等心肌特異性基因顯著上調(diào)表達(dá)。(3)利用miRNA芯片技術(shù)檢測hBM-MSCs和Cps中的miRNA表達(dá)譜,在Cps中上調(diào)表達(dá)的miRNAs(上調(diào)表達(dá)倍數(shù)

5、大于兩倍)有5個(gè):hsa-miR-16、hsa-let-7e、hsa-miR-138、hsa-let-7a、hsa-miR-524。(4)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)4個(gè)miRNAs:hsa-miR-16、hsa-let-7e、hsa-miR-138、hsa-miR-524進(jìn)行驗(yàn)證,與hBM-MSCs組相比,Cps組中4個(gè)miRNAs前體的表達(dá)均顯著上調(diào)。(5)在心肌細(xì)胞微環(huán)境中,過表達(dá)miR-16能顯著上調(diào)hBM-MSC中GATA4、Nkx

6、2.5、MEF2C和CTnI等心肌特異性基因的表達(dá)。(6)miR-16能促進(jìn)心肌微環(huán)境中的hBM-MSCs向CPs分化,可能是通過調(diào)控CCND1,CCND2和CDK6的表達(dá)并阻滯hBM-MSCs細(xì)胞周期于G1期來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論:(1)經(jīng)骨髓直接貼壁法分離所得到的細(xì)胞為純度較高的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。(2)體外模擬心肌微環(huán)境可誘導(dǎo)hBM-MSCs向Cps分化;hBM-MSCs向Cps分化前后的miRNAs表達(dá)譜發(fā)生變化,提示差異表